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酵母双杂交系统检测相互作用原理基本流程及注意事项

基本原理

酵母双杂交系统由Fields和Song等首

先在研究真核基因转录调控中建立i。典型

的真核生长转

录因子，如GAL4、GCN4、等都含有

二个不同的结构域:DNA结合结构域(DNA-

bindingdomain)和转录激活结构域(transcription-activating

domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定

位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成

分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区

适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转

录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达

探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体:a含DNA-binding

domain的载体;b含DNA-activatingdomain的载体。上述二类载

体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融

合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动

报告基因的转录。

酵母双杂交系统的建立与发展是基于对真核生物转录调控起始过

程的认识。真核生物中存在一种上游激活序列(upstreamactivating

sequence,UAS)，其作用是和激活蛋白结合并大大增加启动子的转录

速度，从而在转录水平对靶基因表达进行调控。真核细胞转录起始需

要反式转录激活因子的参与。很多真核生物的位点特异性转录激活因

子是组件式的，通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异性结合

结构域(DNA-bindingdomain,BD)与转录激活结构域

(transcriptionalactivationdomain,AD)。这两个结构域即使分开时

仍各具功能，互不影响。但一个完整的某个特定基因的转录激活因子

必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活功能。只有将这两部

分通过适当的途径在空间上接近才能恢复其激活转录的能力。不同来

源的ＢＤ与ＡＤ结合后则特异地激活ＢＤ结合基因的表达。基于这一

特性，Fields等设计了一个检测蛋白质与蛋白质相互作用的系统。选

择的转录激活因子是酵母细胞中的GAL4蛋白。分离GAL4蛋白N端

的1-147个氨基酸（BD）和C端的768-881个氨基酸（AD），分别

构建重组质粒。如果在BD上接上一个蛋白X，在AD上接一个蛋白Y，

再将这二个质粒共同导入酵母菌中，若X，Y蛋白在酵母内发生交互作

用，则相当于将GAL4的BD和AD又连在一起，即可以转录激活下游

报告基因的表达，通过测定报告基因的产物及活性来检测这种交互作

用的发生。理论上，任何能在酵母中表达的基因均可作为报告基因，

较为常用的是LacZ，和一些营养缺陷标记，这种报告基因只允许阳性

克隆生长，最常用的是HIS3和LEU2。近来为了更灵敏、特异地筛选

阳性克隆,常同时使用两种或两种以上的报告基因(如ADE2和URA3)，

一则它可以允许用比单纯颜色筛选更大的菌落密度铺板，从而获得较

丰富的表达产物，二则双重筛选相互验证，可以排除一些假阳性结果；

三则转化体制造了大量的融合蛋白以保证基因产物满足生长需要，结

果LacZ转录提高，从而β-半乳糖苷酶的活性亦增牵

注意事项

1.如果诱饵蛋白存在自激活，该如何处理？

该蛋白很可能带有完整的AD区和BD区，是个完整的转录因子，

可以将转录因子基因分成两部分分别进行文库筛选，然后重新检测其

是否自激活，但要注意切割也有可能破坏蛋白之间的相互作用。

2.转化效率太低怎么办？

1)检测感受态细胞效率，标准操作规范。

2)注意质粒使用量，检查仪器状态。

3)重新配制新鲜培养基，并做对照转化。

3.如果诱饵蛋白对酵母细胞是