2024年中图版高中生物考点加强课6限制酶的选择原则.doc

1.限制酶的选择原则

(1)根据目的基因两端的限制酶切點确定限制酶的种类

①应选择切點位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ。

②不能选择切點位于目的基因内部的限制酶，以防破壞目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。

③為防止目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不一样的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要保证质粒上也有這两种酶的切點)，并且這种切點不致于破壞所有的“標识基因”以及启動子和终止子。

(2)根据质粒的特點确定限制酶的种类

①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以保证具有相似的黏性末端。

②质粒作為载体必须具有標识基因等，因此所选择的限制酶尽量不要破壞這些构造，应至少具有一种完好的標识基因，如图乙中限制酶pstⅠ因其會破壞標识基因而不适宜选择。

③所选限制酶切點不应位于复制原點处以防破壞复制原點，假如所选酶的切點不止一种，则切割重组後也許會丢失某些片段，若丢失的片段含复制原點区，则切割重组後的片段進入受体细胞後不能自主复制。

④所选限制酶，其切點应位于启動子与终止子之间，如图乙中HindⅢ會破壞启動子，EcoRⅠ會破壞终止子，而NdeⅠ和BamHⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启動子与终止子之间。

(3)参照Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶

若质粒上標出T－DNA片段，则所选限制酶切點应位于T－DNA片段中，從而有助于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——由于Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，如用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ(两种酶切出的黏性末端不一样)切割某DNA，获得含目的基因的片段。若运用该片段构建基因体現载体，则下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不适宜选择，而丙Ti质粒宜选用。(分析如下)

2.目的基因的检测与鉴定

(1)界定“標识基因”与“DNA分子杂交技术”在目的基因检测中的作用：

①载体上標识基因的標识原理

载体上的標识基因一般是某些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵御有关抗生素的能力。當具有抗生素抗性基因的载体進入受体细胞後，抗性基因在受体细胞内体現，使受体细胞可以抵御對应抗生素，因此在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明無质粒转入，當然不會有“目的基因”转入，能存活時必含该载体，原理如下图所示：

②“標识基因”筛选後為何還需应用“DNA分子杂交技术”确认目的基因与否转入？

經上述环节筛选得到的受体细胞，只是含特定的標识基因的质粒，然而，该质粒上与否成功嵌入了目的基因，還不能确定，故仍需使用“目的基因”作探针，运用DNA分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上与否含目的基因。

(2)使用“目的基因”作探针，运用“分子杂交技术”检测目的基因与否转录出特定mRNA。

(3)采用“抗原—抗体杂交技术”，從转基因生物中提取蛋白质(作抗原)与對应抗体杂交，根据与否出現杂交带确认目的基因与否“指导”特定蛋白质的合成。

(4)采用抗虫、抗病毒等“接种试验”進行目的基因成功体現的“個体生物學”水平的检测。

【例证】(·全国卷Ⅲ，40)图(a)中的三個DNA片段上依次表达出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位點，图(b)為某种体現载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。

根据基因工程的有关知识，回答問題：

(1)經BamHⅠ酶切後得到的目的基因可以与上述体現载体被酶切後的产物连接，理由是______________________________________________________

____________________________________________________________________。

(2)若某人运用图(b)所示的体現载体获得了甲、乙、丙三种具有目的基因的重组DNA分子，如图(c)所示，這三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中体現目的基因产物的有，不能体現的原因是_________________________________________________________________

_________________________________________________________________。

图(c)

(3)DNA连接酶是将两個DNA片段连接起来的酶，常見的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是__________________________。

[慧眼识图获取信息]

(1)三种限制酶切割成果分析

(2)体現载体与重组DNA分子分析

答案(1