抗体的制备—单克隆抗体的制备（免疫学检验技术课件）.pptx

单克隆抗体的制备

单克隆抗体的制备单克隆抗体概念/特性概念：是由单个B细胞克隆产生的仅针对一种抗原表位的高特异性抗体，可用杂交瘤技术制备。特性：理化性状专一、生物活性专一、纯度高、易于标准化。

单克隆抗体的制备单克隆抗体制备的总体思路Ag致敏B细胞（产Ab）骨髓瘤细胞（无限繁殖）杂交瘤细胞（产Ab+无限繁殖）单克隆抗体（McAb）两种细胞融合后产生的杂交细胞可同时保持双方亲代细胞的主要生物学特征

单克隆抗体的制备单克隆抗体制备的基本过程克隆选择学说/细胞代谢缺陷补救的机制Ag（SRBC：多种表位）小鼠脾细胞（产Ab）小鼠骨髓瘤细胞（长期繁殖）+细胞融合PEGHAT培养筛选、检测、克隆化B细胞杂交瘤细胞株（目标株）McAb

单克隆抗体的制备单克隆抗体制备的基本方法（1）细胞的选择与制备1)免疫脾细胞动物要求：与所用骨髓瘤细胞同源（小鼠），3-5只鼠龄8-12w的BALB/c健康小鼠。抗原要求：颗粒性抗原/可溶性抗原（+弗氏完全佐剂）。免疫途径：腹腔或皮内。

单克隆抗体的制备单克隆抗体制备的基本方法2)骨髓瘤细胞要求：来源与制备脾细胞动物同一品系；自身不分泌Ig及CK，对B细胞产生Ab无抑制作用；可体外连续培养，生长快，倍增期短于24h；HGPRT缺陷株；处于对数生长期，形态良好。

单克隆抗体的制备单克隆抗体制备的基本方法3)饲养细胞常用：小鼠腹腔巨噬细胞制备方法：冷冻果糖液注射腹腔，轻柔腹部几次，吸出腹腔液，内含巨噬细胞。

单克隆抗体的制备单克隆抗体制备的基本方法（2）细胞融合脾C（4份）+骨髓瘤C（1份）PEG，2min培养液稀释混合物培养板孔中培养

单克隆抗体的制备单克隆抗体制备的基本方法融合后的细胞混合物脾细胞瘤-瘤细胞瘤细胞脾-脾细胞脾-瘤细胞

单克隆抗体的制备单克隆抗体制备的基本方法（3)杂交瘤细胞选择培养1）DNA合成途径主要合成途径【原料：糖、AA、叶酸】替代途径【原料：次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶核苷（T）、HGPRT、TK】

单克隆抗体的制备单克隆抗体制备的基本方法2）HAT培养基次黄嘌呤（H）、甲氨蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T）。其中A为叶酸拮抗剂。3）HAT培养混合细胞经HAT培养后仅有脾-骨髓瘤C（混合物：针对Ag多种表位）。

单克隆抗体的制备单克隆抗体制备的基本方法（3)杂交瘤细胞克隆化培养从针对不同表位的杂交瘤细胞群体中筛选出针对目的抗原表位的特异性抗体分泌细胞。筛选的方法：多次进行单个细胞培养，即克隆化。克隆化最常用的方法：有限稀释法。

单克隆抗体的制备有限稀释法连续稀释杂交瘤细胞悬液，使96孔板培养板每孔细胞数为一个，取每孔上清液，测抗体含量，抗体高分泌孔，多次克隆化（3～5次），获杂交瘤细胞克隆。123456

单克隆抗体的制备单克隆抗体制备的基本方法（4)杂交瘤细胞冻存阳性克隆：及时冻存，液氮冷冻保存法（-196℃）

单克隆抗体的制备单克隆抗体制备的基本方法（5)McAb的大量制备1）体外培养法（单层细胞培养法、高密度培养法）2）动物体内诱生法（小鼠腹腔接种）

单克隆抗体的制备单克隆抗体制备的基本方法（6)McAb的纯化、鉴定、应用1）纯化（方法：亲和层析等）2）鉴定（方法：ELISA等）3）应用：诊断试剂、临床治疗、物质提纯。