目的基因连接及导入.ppt

（2）电转化法也有人称做高压电穿孔法（简称电穿孔法），即在受体细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，使质膜形成纳米大小的微孔，DNA能直接通过这些微孔，或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布而进入细胞质中。该法可用于真核细胞(如动物细胞和植物细胞)和原核细胞(转化大肠杆菌和其他细菌等)的外源DNA的直接导入。????电穿孔法具有简便、快速、效率高等优点电击的处理方式对转化率有着决定性的作用，有两种不同的处理方式：一种是较低的电压，处理较长的时间（350V/cm54s）；另一种是高电压，短时间处理（1－1.25kV/cm,10s)。一般常用第二种处理方式。第31页,共51页，星期六，2024年，6月1.磷酸钙沉淀法??利用磷酸钙-DNA共沉淀，把外源基因与λ噬菌体DNA的重组分子导入大肠杆菌和哺乳动物细胞，简称磷酸钙沉淀法。细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这种方法导入细胞，而且可在电子显微镜下清楚地看到细胞吞噬DNA-磷酸钙复合颗粒。此法的转染效率远远不如体外包装法。（3）直接吸收法：第32页,共51页，星期六，2024年，6月Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化的可能原因：①在0℃的Cacl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。第33页,共51页，星期六，2024年，6月第34页,共51页，星期六，2024年，6月该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每μg质粒DNA可以获得5×106～2×l07个转化茵落，完全可以满足质粒的常规克隆的需要Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用，因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞，可以提高DNA的转化效率。如利用二甲基亚砜(DMSO)和二硫苏糖醇(DDT)等进一步处理细胞，能诱导高频感受态细胞的形成，转化效率可提高100～1000倍，且对大小质粒分子均可进行有效的转化。但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常很少采用。第35页,共51页，星期六，2024年，6月（4）基因枪技术又称高速微型子弹射击法、微弹射击法、高速粒子轰击法基本原理：将DNA吸附在微型子弹(1μm)的表面通过放电或机械加速，使子弹射入完整的细胞或组织内。基本做法：先将外源DNA溶液与钨、金等金属微粒(直径0.5-5μm)共同保温，使DNA吸附于金属颗粒表面，然后放电加速金属颗粒，使之以400m/s的速度直接喷射受体细胞，外源遗传物质随金属颗粒进入细胞内部。第36页,共51页，星期六，2024年，6月基因枪转化的操作步骤靶细胞或组织的预处理微粒子弹的制备装备基因枪轰击过渡培养进行筛选培养或直接分化再生植株PDS-1000|HeSystem第37页,共51页，星期六，2024年，6月无宿主限制：农杆菌介导法只对双子叶植物敏感，限制了它的应用范围。而基因枪没有物种限制。靶受体类型广泛：可以是原生质体，叶片，悬浮细胞，茎或根切段，种子胚，愈伤组织，花粉等。操作简单快速基因枪法转化的优点有：便携式基因枪第38页,共51页，星期六，2024年，6月1.体外包装转染法又称感染，将目的基因放在载体上，感染到要表达的细胞中,并在宿主菌体内扩增和表达外源基因。常用的载体是质粒、λ噬菌体、科斯质粒。2、间接导入法第39页,共51页，星期六，2024年，6月2.脂质体介导法???脂质体(又叫做人工膜泡)作为体内或体外输送载体的方法，一般都需要将DNA或RNA包囊于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞。这种方法具有许多方面的优点,包括可保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用,降低了对细胞的毒性效应,适用的植物种类广泛,重复性高,包装在脂质体内的DNA可稳定地贮藏等。第40页,共51页，星期六，2024年，6月人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病，该病在法国、东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积发生。1907年Smith和Townsent等首先发现这种冠瘿瘤病是由根癌农杆菌引发的。3.农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化第41页,共51页，星期六，2024年，6月Tumor