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柳蚕eiger基因的克隆及序列分析

摘要：柳蚕是鳞翅目大蚕科昆虫的一种，柳蚕蚕茧为重要的蚕丝原料。Eiger作为无脊椎动物中与肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF)的直系同源物，被证实在昆虫的先天免疫中起到重要作用。Eiger基因最早发现于果蝇中，且相关研究主要集中在家蝇、果蝇，在柳蚕中尚无相关的研究。基于此，本文以柳蚕为实验材料，将柳蚕eiger基因用RT-PCR法进行克隆，并对实验结果所得序列进行生物信息学相关分析，为进一步研究柳蚕eiger的功能奠定基础。本文实验主要结果如下：

成功克隆得到柳蚕eiger基因阅读框的全长序列，1473bp，编码490个氨基酸，使用软件预测柳蚕eiger蛋白的分子量为55.09kDa，等电点为5.47，无信号肽。

序列分析与构建的系统进化树显示，柳蚕eiger蛋白与烟草天蛾具有较高的同源性。eiger蛋白为Ⅱ型跨膜蛋白，c端TNF同源。

关键词:柳蚕、Eiger、先天性免疫、基因克隆、序列分析一、前言

1.1昆虫的免疫系统

昆虫没有高等动物中分化很明显的免疫组织器官，昆虫的免疫组织器官主要是血淋巴和脂肪体，昆虫的免疫细胞主要是血细胞。昆虫没有高等动物的抗体和补体系统，但是昆虫可产生具有免疫功能多肽，其由昆虫的脂肪体和血细胞合成，其功能类似高等动物分泌的免疫分子。并与细胞一起组成昆虫体内具有免疫功能体系[1]。此外，昆虫的免疫系统没有明显的记忆功能，不产生特异性的效应细胞和记忆细胞。因此，昆虫不能形成类似高等动物的一次感染终生免疫的生理现象。

昆虫的免疫系统包括：阻止异物侵染的体壁、消化道等物理性屏障、体内的细胞防卫和多种具有免疫功能的抗菌肽组成的体液[2]。

昆虫的免疫细胞主要是血细胞。外源异物入侵可以刺激血细胞分裂增殖，通过吞噬、包围、凝集作用抵抗外源异物。因此，对异物的识别是昆虫免疫的重要一步。

昆虫虽没有高等动物般抗体-抗原识别机制，但昆虫也具有识别异物的机制，可以通过微生物细胞表面特有的物质（如：肽葡聚糖、脂多糖、β-1，3-葡聚糖）进行识别。实验中，给家蚕和烟草天蛾注射细菌和肽葡聚糖，均能有效诱导昆虫脂肪体合成溶菌酶、天蚕素和血清等血淋巴蛋白，进而识别革兰氏阴性菌[3]。

当家蚕处于变态期或给家蚕注射肽葡聚糖，脂多糖和大肠杆菌。均可从蚕体中分离出一种较为特别的凝集素，类似于高等动物的血小板凝集因子。

此外，从天蚕蛾与烟草天蛾体内分离到的血素是一个含有重要免疫球蛋白序列的蛋白质，血素黏着到细菌表面，可以刺激血细胞的吞噬。

1.2昆虫先天免疫简介

1.2.1昆虫的细胞免疫

昆虫的血细胞来源于中胚层细胞。一般认为，昆虫的原细胞是昆虫体内最基本的血细胞，其他血细胞均由其分化而来，原血细胞还具有分裂增殖的能力。凝血细胞、浆细胞、粒细胞是昆虫免疫反应中最重要的血细胞，其形态、功能各有不同。它们通过循环运动与异物接触，而后通过特定的功能分子识别结合而产生防卫反应，从而对不同入侵昆虫的异物进行吞噬、凝集成瘤或包被作用[4,5]。

吞噬作用通常发生于少量且小型的异物侵入之后，是一种由粒细胞和浆细胞完成的受体调节的免疫反应。聚集成瘤作用则发生在大量且小型的微生物入侵昆虫体内之后，使得血细胞、血浆物质以及异物凝集成瘤，而后被血细胞包被的免疫过程[1]。包被作用是昆虫血细胞对大型外来入侵异物所做出的免疫反应。如：在双翅目昆虫中首先由血细胞识别后溶解释放信号因子，形成黑化的提液物质包被，而后再由细胞包被或不包被。此外，这些大型外源异物可以通过改变外衣和分泌的特性，或在入侵时同时带入病毒，从而破坏寄主的识别、黏着或包被，从而建立寄生关系。

2.2昆虫的体液免疫

抗菌肽是昆虫体液免疫中的重要抗菌因子具有广谱抗菌性，对抗外源性病原体作用的防御性肽类活性物质是动物免疫系统的一个重要组成部分[6]。不仅能杀死革兰氏阳性及阴性菌，还有抗真菌、病毒、原虫以及抑制癌细胞的活性等作用。昆虫抗菌肽的产生是外界因素诱导作用发生的生物效应，可被各种各样的刺激多诱导产生。实验研究表明，同一种蚕蛹经过不同诱导源的诱导，可以形成同样的抗菌肽，而不同种属的蚕被诱导产生的抗菌肽有明显差异[7]。

根据分子结构的不同，可将昆虫抗菌肽分为4个肽族：天蚕素、环状的抗菌肽、富脯氨酸抗菌肽、富含甘氨酸抗菌肽。其中人类研究最多、了解最为清楚的是第一肽族：天蚕素族[8]。从20世纪70年代中期人类首次从惜古比天蚕蛾中获得抗菌开始，人类对昆虫体液免疫的了解与研究越来越深。现如今，我们已经清楚的知道天蚕素对细菌的杀灭是由于在细胞膜表面形成大的离子孔道，进而细胞外离子和水内渗，从而使得入侵者细胞裂解死亡。

Eiger基因

Eiger