PCR讲课完整版本.pptVIP

PCR(PolymerasechainReaction)中文全称是聚合酶链式反应。是指在体外选择性扩增DNA某个特殊区域的技术。具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等优点能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑1985年，美国PE-cetus公司人类遗传研究室的Karymullis发明了具有划时代意义的PCR技术1993年，Karymullis因发明PCR技术获得诺贝尔化学奖；一、PCR技术的工作原理PCR体系基本组成成分模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPMg2+PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点平台效应逆转录PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。原位PCR(insituPCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。总结与复习:PCR的工作原理延伸：1、到图书馆查阅引物设计的原则2、动画中出现的35℃是什么意思?3、PCR的优化问题，如我们在实验中出现非特异性产物，从PCR优化的角度来看，如何解决？*PCR技术的原理与应用PCR的基本反应步骤Polymerase_Chain_Reaction.mov变性92-96?C延伸72?C退火Tm-5?C45?C-72?CCycle25-35次①变性（denaturation）在高温条件下，双链模板DNA的氢键断裂，解链成两条单链DNA，提供复制的模板。模板DNA95℃②退火（annealing）突然降温，在（45~72℃）条件下，使加入的引物与单链DNA模板上待扩增DNA区域的两个侧翼准确地按碱基互补原则结合，并提供DNA复制起始的3′-OH。50℃引物1引物2DNA引物变性后温度快速冷却至40℃～60℃，也存在两模板之间的结合。但由引物浓度极高，远远多于模板DNA浓度，模板DNA比引物复杂得多，故引物与模板DNA结合的机率远远高于DNA分子自身的复?性。③延伸（extension）DNA聚合酶在适当温度（70～75℃）下，以dNTP为原料，从特异结合到DNA模板上的引物3′-OH端开始，根据碱基互补配对和半保留复制原则，进行DNA链的延伸，合成与模板互补的新的DNA分子。70℃引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶第1轮结束95℃第2轮开始50℃TaqTaqTaqTaq72℃第2轮结束模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理论上讲PCR扩增产物数量每轮循环都增加一倍。应按2n-2n的数量递增。PCR反应中，当引物、模板、DNA聚合酶达到一定比值时，DNA聚合酶催化的反应趋于饱和，出现“平台效应”，PCR反应产物不在增加。利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。二、PCR技术的主要用途（一）目的基因的克隆利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。（三）DN