融合型幽门螺杆菌粘附素基因工程疫苗的构建及其制备方法 .pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(10)申请公布号CN1563388A

(43)申请公布日2005.01.12

(21)申请号CN200410022186.7

(22)申请日2004.03.29

(71)申请人中国人民解放军第三军医大学

地址400038重庆市沙坪坝区高滩岩正街30号

(72)发明人邹全明刘正祥洪愉朱永红童文德解庆华

(74)专利代理机构重庆华科专利事务所

代理人康海燕

(51)Int.CI

C12N15/62

C12N15/31

C12N15/63

C12N15/11

C12N15/09

C12N15/70

C07K1/14

C12P21/02

A61K38/16

权利要求说明书说明书幅图

(54)发明名称

融合型幽门螺杆菌粘附素基因工程

疫苗的构建及其制备方法

(57)摘要

本发明公开了融合型幽门螺杆菌粘

附素基因工程菌疫苗的构建及其制备方

法，其特征在于用粘附素HpaA通过基因

重组方法构建幽门螺杆菌粘附素与大肠杆

菌不耐热肠毒素B亚单位或霍乱毒素B亚

单位分子内佐剂融合工程菌，经过高密度

发酵、包涵体提取、复性及纯化大量获得

所需疫苗蛋白，该疫苗可以分别被制备成

口服剂、注射剂及滴/喷鼻剂。该基因工程

疫苗构建方法独特，制备工艺简捷、容易

放大、重复性好，所获疫苗蛋白纯度高，

动物试验证明可有效刺激机体产生较高的

免疫应答和免疫保护作用。

法律状态

法律状态公告日法律状态信息法律状态

权利要求说明书

1.一种融合型幽门螺杆菌粘附素基因工程疫苗的构建及其制备方法，其特征在于：

首先，克隆LTB或CTB、HpaA基因，构建融合LTB-HpaA或CTB-HpaA表达载

体和高效表达菌株；然后，用发酵方式高密度表达融合蛋白；最后，采用包涵体提

取，复性，离子交换层析、凝胶过滤层析纯化技术的颗序组合，大量获得LTB-

HpaA或CTB-HpaA，并将该疫苗分别制备成口服剂、注射剂及滴/喷鼻剂。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征是克隆LTB、CTB、HpaA基因的步骤

在于设计合成以下引物：

LTBP15’-uccatgg/uctccccagtctattacag-3’(NcoI)

P25’-uggatcc/utgcggcgcgtagttttccatactgattgccg-3’(BamHI)

CTBP35’-ccucatgg/ugatgattaaattaaaatttg-3’(NcoI)

P45’-cggugatc/utgcggcgcgtaaacggtatgattaacgc-3’(BamHI)

HpaAP55’-uggatcc/utacgaatgaagtcgctttgaaat-3’(BamHI)

P65’-uctcgag/utcggtttcttttgcc-3’(XhoI)

下划线部分为酶切位点。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征是：构建融合LTB-HpaA或CTB-HpaA

表达载体和高效表达菌株的步骤是：先将LTB或CTB与表达质粒连接后，再与

HpaA基因连接，转化大肠杆菌，经酶切、测序分析得到含有LTB-HpaA和CTB-

HpaA的重组表达质粒。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是其发酵、纯化包括下述顺序的步骤：

(1)发酵：发酵过程中种子菌10％接种，保持70％溶氧、温度37℃、pH7.0，在

A600未达到2时不加补料，之后每3h流加补料一次使葡萄糖、胰化蛋白胨和8％

酵母抽提物的终浓度分别为