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食用油中辣椒素的测定时间分辨荧光免疫层析法

1范围

本文件描述了时间分辨荧光免疫层析法测定食用油中辣椒素的方法。本文件适用于大豆油、菜籽油、花生油等食用油中辣椒素的测定。

本文件辣椒素的检出限为0.4μg/kg。方法定量范围为0.4-12.5μg/kg。

2规范性引用文件

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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3原理

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

试样中辣椒素与铕乳胶标记的特异性抗体发生结合后，抑制了层析过程中抗体与硝酸纤维素膜检测线上辣椒素-BSA偶联物的免疫反应，使检测线时间分辨荧光强度降低，通过检测时间分辨荧光强度变化进行定量测定。

5试剂

5.1水，按照GB/T6682中的要求，二级。

5.2甲醇（CH3OH）。

5.3氯化钠（NaCl）。

5.4牛血清白蛋白（BSA）．纯度大于98%。

5.5吐温﹣20（C58H114O26）。

5.6二氯甲烷（CH2Cl2）。

5.7石油醚：沸程60～90℃。

5.8氢氧化钠（NaOH）。

5.9浓硫酸（H2SO4）。

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5.10pH试纸：0～14。

5.11铕标记辣椒素抗体溶液。

5.12辣椒素标准液：准确称取辣椒素2.5mg于25mL容量瓶中，甲醇定容，配置成100μg/L的溶液。-20℃保存7天，备用。

5.132%NaOH溶液：称取20gNaOH（5.8）溶于1000mL水中，摇匀备用。

5.14稀硫酸（1+15）溶液：取10mL浓硫酸（5.9）缓缓倒入150mL水中，备用。

5.15天然辣椒素（C18H27NO3，CAS号：404-86-4）：纯度≥98%，或经过国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

6仪器设备与材料

6.1时间分辨荧光检测仪：激发波长（365±5）nm，检测波长（615±5）nm。

6.2辣椒素时间分辨荧光免疫层析装置：固定有辣椒素-BSA偶联物，用于样品中辣椒素与铕标记抗体预反应后再与辣椒素-BSA偶联物反应的载体（见图1）。

图1辣椒素免疫层析装置示意图

6.2.1辣椒素-BSA偶联率为1:5~1:20（BSA：辣椒素）。

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6.2.2样品垫：玻璃纤维、酯纤维或纸质薄片。

6.2.3硝酸纤维素膜：4cm毛细时间不小于135s。

6.2.4吸水纸。

6.2.5底板。

6.2.6连接胶带。

6.3离心机：4000r/min。

6.4分析天平：感量0.01g。

6.5恒温装置：温控范围为（37.0士2.0）℃。

6.6漩涡混匀仪。

6.7微量移液器：10μL~200μL,100μL~1000μL。

6.8量简：10mL。

6.9辣椒素抗体溶液包被微孔：取150μL铕标记辣椒素抗体溶液，冻干备用。

6.10滤膜：0.22μm，水系。

6.11注射器：2mL。

6.12手持读数仪。

6.13耗材：枪头、离心管、50mL量筒、计时器等。

7分析步骤

7.1用10mL离心管称取2.00±0.01g食用油，然后使用滴管在分析天平（6.4）上称取2.65±0.03g二氯甲烷加入其中。

7.2用移液枪准确加入2mL试剂2%NaOH溶液（5.13），漩涡混匀仪（6.6）充分提取5min（注意：保证上下充分混匀），以4000g的转速离心3min。

7.3用移液枪缓慢取上清液1.5mL加入至含0.28gNaCl（5.2）的10mL离心管内（注意：尽量避免取到分层界面处杂质），充分涡旋混匀至试剂NaCl（5.2）全部溶解。

7.4使用注射器吸取全部液体过0.22μm水系滤膜净化后，移液枪取净化后1mL液体至10mL离心管内，再加入200μL稀硫酸（1+15）溶液（5.14）混匀。

7.5使用滴管称在分析天平（6.4）上取1.29±0.02g石油醚（沸程60-90oC）加入其中后混匀1分钟，静置分层。

7.6使用滴管称在分析天平（6.4）上称取0.64±0.01g石油醚上清液至10mL离心管内氮吹/空气吹干后，加入150μL纯水涡旋充分混匀1分钟，取10