基因工程讲义2.ppt

5基因克隆的酶学基础（1）核酸内切限制酶（restrictionendonucleases）1）寄主控制的限制(restriction)与修饰现象(modification)2）核酸内切限制酶的类型(I型、II型、III型）3）核酸内切限制酶的基本特性同裂酶（isoschizomers）同尾酶（isocaudamer）4）核酸内切限制酶的命名法大肠杆菌（Escherichiacoli）缩写为Eco流感噬血菌（Haemophilusinfluenzae）缩写为Hin5）影响核酸内切限制酶活性的因素a.DNA的纯度，b.DNA的甲基化程度，c.反应温度，d.DNA的分子结构，e.核酸内切限制酶的缓冲液6）核酸内切限制酶对DNA的消化作用a.结合模式，b.局部消化，c.消化作用

核酸内切限制酶EcoRI及修饰的甲基化酶MEcoRI的限制与修饰作用

核酸内切限制酶HindIII对双链DNA分子的切割作用

具有粘性末端的DNA片段结合方式

碱性磷酸酶的脱磷酸作用阻止线性的质粒DNA分子再环化

（2）DNA连接酶（Ligase）1）粘性末端DNA片段的连接2）平末端DNA片段的连接a.同聚物加尾法（homopolymertail-joining）b.衔接物连接法（linker）c.DNA接头连接法（adapter）3）热稳定的DNA连接酶（thermostableDNAligase）a.寡核苷酸连接测定法（oligonucleotideligationassay）b.连接酶链式反应（ligasechainreaction，LCR）或连接扩增反应（ligationamplificationreaction）a）裂口连接酶链式反应LCR探针（LCRprobe）b）不对称裂口连接酶链式反应（AG—LCR）

应用互补的同聚物加尾法连接DNA片段

用衔接物分子连接平末端的DNA片段

双衔接物连接法的基本程序

具异常的5’-OH粘性末端结构的BamHI接头的连接机理

寡核苷酸连接测定原理

DNA连接酶链式反应（LCR）原理

不对称裂口DNA连接酶链式反应（AG-LCR）的分子机里

（3）DNA聚合酶（DNApolymerase）1）DNA聚合酶Ia.DNA缺口转移（nicktranslation）b.DNA杂交探针的制备2）大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段与DNA末端标记3）T4DNA聚合酶取代合成法标记DNA片段4）依赖RNA的DNA聚合酶与互补DNA的合成5）T7DNA聚合酶6）修饰的T7DNA聚合酶

DNA聚合酶I催化合成DNA合成链按5’—3’方向延长

线性和环形DNA分子的取代缺口转移

用T4DNA聚合酶的取代合成法标记DNA片段末端制备探针

（4）DNA和RNA的修饰酶1）末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾（terminaldeoxynucleotidyltransferase）2）T4多核苷酸激酶（polynucleotidekinase）与DNA分子5’末端的标记3）碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用细菌碱性磷酸酶（bacterialalkalinephosphatase）小牛肠碱性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase）（5）核酸外切酶（exonucleases）1）核酸外切酶VII（exoVII）2）核酸外切酶III（exoIII）3）入核酸外切酶（入exo）和T7基因6核酸外切酶

碱性磷酸酶的活性

（6）单链核酸内切酶（singleendonucleases）1）SI核酸酶与RNA分子定位2）Bal31核酸酶与限制位点的确定