昆虫线粒体基因组研究方法ppt课件.pptx

昆虫线粒体基因组研究方法

一.昆虫线粒体基因组的研究意义

（一）适合做进化生物学研究。被广泛用于研究基因组结构和功能、群体遗传结构，谱系地理学和各种分类学水平上的系统发育关系研究。

（二）功能基因的研究

二.研究方法

（一）获取待研究昆虫的线粒体基因组

（二）对线粒体基因组结构进行分析

（三）与其他昆虫线粒体基因组进行比对

（四）进行系统发育分析

具体步骤

1.采集标本并冷冻

2.提取DNA

3.扩增线粒体基因组上的经典片段

4.设计引物，扩增其他片段

5.将所有片段拼接成完整的线粒体组（环形）

6.校对数据，利用软件、比对等方法，标出tRNA、16S、12S及13个蛋白质基因的位置，上传线粒体基因组数据至Genbank。

7.对tRNA进行结构预测

8.对12S及16S进行结构预测

9.对该昆虫线粒体基因组上特殊位置进行讨论

10.系统发育分析

1.采集标本及冷冻

利用高压汞灯及黑光灯诱集，然后将标本低温冷冻致死，取一侧后足泡入无水乙醇，置于-20度冰箱保存，供提取DNA。标本展翅并保存，以待进一步形态鉴定。

2.DNA提取

总DNA提取试剂盒为德国默克公司QIAGENDNeasyTissuekit。PCR试剂使用TIANGEN天根生化科技有限公司生产的PCRMasterMix。

将浸泡于无水乙醇中的足取出，晾干，分成2-3段，放在1.5ul的离心管中。按照QIAGENDNeasyTissuekit使用手册的说明进行总DNA提取。抽提的DNA溶于200-300ul的AE缓冲液，并置于在-20℃冰箱保存备用。

5.将所有片段拼接成完整的线粒体组（环形）

利用软件DNAstar对扩增好的各个片段进行拼接。用Bioedit软件查看测序原始峰图，校对各个碱基。将校对好的数据上传至Genbank。获取Genbank的accession

number。

6.寻找tRNA及预测tRNA结构

用tRNAscan-SESearchServer在线软件，寻找tRNA，一次可找出17-19个。其余与其他昆虫线粒体进行比对找出。

用DNAsis预测tRNA结构，对于较为特殊的tRNASer(AGN)，需手工画出。

7.预测12S及16S结构

用软件XRNA进行预测。预测不到的，用手工画出。

8.对特殊结构进行分析讨论

例：控制区的结构分析

在线软件MfoldWebServer(Zuker,2003;/?q=mfold)

9.系统发育分析

用软件MEGA5.0，RAxML,Paup4.0,mrbayes等软件进行分析