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基因融合技术及其应用

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?近年来，基因融合技术已在生物医学研究领域中得到愈来愈广泛的应用。在结构生物学领域，构建重组融合蛋白可以增加可溶性蛋白的表达，有利于蛋白的纯化fAltmanetal．，1991：Samuelssonefal，1991)，也可用于体外实验研究蛋白的功能和活性(GoulaouicandChow，1996；BushmanandMiller，1997)；在生物工程领域中可以用于筛选和生产抗体、多功能酶工程、特定功能的蛋白(特异性靶基因的蛋白)(KimandPabo，1997；Tangetal．，2000)。本文对基因融合技术及近年来的主要应用作简要综述。

1基因融合技术

?基因融合技术是将不同的基因连接起来从而表达具有复合功能的融合蛋白，构建融合蛋白的基本原则是：将第一个蛋白基因的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现2个基因的融合表达。融合蛋白除了具有衍生因子的双重活性外，其各自的活性可能发生如下变化。

1．1一些融合蛋白的活性较各自野生型低

HBsAg和小鼠IL—18融合蛋白诱导BALB／c鼠免疫应答的能力时，融合表达质粒不能增强免疫应答，反而降低了机体的免疫应答水平(柯亨宁等，2001)。IL-2与IL—15的融合分子未能显著提高IL-15分子的功能(OzdemirandSavasan2005)。

1.2活性与野生型因子活性的相加作用一致

WeichefaJ．(1993)构建了3种IL3和促红细胞生成素不同组合方式的融合蛋白并在CHO细胞表达，受体结合实验及生物活性分析表明，IL3和促红细胞生成素的融合蛋白的活性并不比两种因子联合使用的活性高。

1．3融合蛋白的活性高于衍生因子的相加活性

HazamaetaJ．(1993)用IL-2和单纯疱疹病毒胞膜糖蛋白D构建的重组融合分子研究表明，融合蛋白在体内具有协同与增强作用。用基因重组方法将表达IL-2和I-IBV的preS的质粒转染Cos-7细胞，该细胞分泌表达的IL-2preS融合蛋白保留了IL-2和preS抗原天然分子的生物学活性，且能增强preS抗原的免疫原性，产生协同作用，促进机体免疫应答。IL-2preS诱导小鼠产生的抗preS抗体较单独preS抗原诱导产生的高达8倍左右，说明IL-2preS融合蛋白产生了协同作用，增强了preS抗原的免疫原性，增强了免疫应答的效应(周卫红等，1999)。

1．4人工构建的新蛋白可能具有与衍生因子无关的新活性

E．coli表达的IL-6和IL-2融合蛋白CH925，生物活性分析结果显示，CH925不但可以提高不同级别的红系祖细胞的增殖，还能提高LAK细胞的体外增殖(赵春华等，1995)。

2影响基因融合的主要因素

2．1?融合蛋白接头(1inker)的设计和选择

将2个或多个不同的模块连接成为一个大分子，其中起连接作用的氨基酸链即为linker，具有一定柔．I生以允许两侧的分子完成各自独立的功能。设计linker接头时应考虑以下几个因素。

2．1．1linker的长度?一般是在10～15个氨基酸之间。若使用的linker较长，由于在重组蛋白的生产过程中对蛋白裂解比较敏感，可能会导致融合蛋白产量的降低；同时又涉及免疫原性的问题，因接头序列本身就是新的抗原。应用较短的linker虽可克服蛋白酶分解的问题，但可能使2个分子相距太近，影响两种蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰，导致蛋白功能丧失(LaVallieandMccoy，1995)。

2．1.2linker的整体折叠Robinson和Sauer(1998)发现linker序列的组成对融合蛋白的稳定折叠有重大影响。linker序列有太多的仅螺旋或B角结构会限制融合蛋白的伸缩性，结果会影响到融合蛋白的功能活性。因此，设计linker序列时需要仔细分析以避免二级结构的产生。为此，Chiquito和Feng(2000)等开发了软件LINKER，它可以根据输入的参数自动生成一系列linker序列。这个程序x衍射晶体结构或NMR质谱结构推测，适于更广范围的确定融合蛋白中的linker序列。

2．1．3linker中常见的氨基酸非极性的疏水氨基酸如甘氨酸(Gly)、丝氨酸(ser)，因其结构简单，具有构象的广泛性，有利于运动，常出现在蛋白质中运动性大的区域，如绞链区；且体积小的特点又使其利于堆积，不易产生碰撞。Chaudharyetal．(1989)用2个脯氨酸(Pro)作中间接头，具有较好柔韧性，在表达hIL-2／mGM-CSF融合蛋白中获得较理想的结果。

2．1．4linker内部核苷酸序列?调整linker序列(GGGGS)，的核苷酸组成，虽未改变原接头lin