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化妆品用原料重组人源化胶原蛋白的鉴定

1范围

本标准规定了化妆品用原料重组人源化胶原蛋白鉴定术语定义和鉴定操作规程。本标准适用于化妆品用原料重组人源化胶原蛋白的鉴定操作。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

YY/T1888重组人源化胶原蛋白

3中华人民共和国药典术语和定义

YY/T1888界定的术语和定义适用于本文件。

4项目

4.1肽段覆盖率（氨基酸序列覆盖度）

肽段覆盖率是指检测到肽段的氨基酸数量占该蛋白质总氨基酸数量的比例。蛋白质经过酶切后，采用LC-MS进行检测，鉴定到的酶切后肽段占理论序列氨基酸数量的比例。采用质谱法能快速、准确、高效检测蛋白肽段覆盖率。

4.2末端氨基酸序列

胶原蛋白的末端标志着DNA转录翻译成蛋白质过程的初步完成，参与和调控了蛋白质的各种生理功能。研究末端氨基酸序列不仅有利于完整蛋白质的鉴定，对于在分子水平理解蛋白质的信号传导和生化功能也是十分必要的。使用蛋白酶对供试品进行酶解处理后，采用LC-MS/MS对酶解后样品进行检测，通过软件对LC-MS/MS原始文件进行分析，获得重组人源化胶原蛋白末端序列检测结果。

4.3氨基酸序列确认

根据YY/T18885.3.1的描述要求，企业提供的理论氨基酸序列及检测结果，将氨基酸序列与人胶原蛋白数据库进行比对，如NCBI数据库（/Blast.cgi）。根据数据库匹配结果确认其是否为重组人源化胶原蛋白。

5设备和材料

5.1设备和材料

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超纯水仪；分析天平（十万级）；离心机；水浴锅或恒温箱；涡旋仪；高效液相色谱仪；高效液相色谱串联质谱仪；色谱柱；PTFE滤膜；PVDF膜；Prosorb。

5.2试剂

a)50mM碳酸氢铵：0.1580g碳酸氢铵溶解到40mL水中；

b)7M盐酸胍：16.7176g盐酸胍中加入50mM碳酸氢铵25mL；

c)1MDL-二硫苏糖醇（DTT）：精密称取0.1542gDTT加7M盐酸胍1.0mL溶解，即得；d)1M碘乙酰胺（IAM）：0。9248g碘乙酰胺溶解到5mL7M盐酸胍；

e)Lys-C；

f)甲酸、乙腈，使用质谱纯。

6操作规程

6.1肽段覆盖率

6.1.1样品处理

1)取250ug蛋白溶液置于超滤管中，用50mM碳酸氢铵溶液补足体积150ul。14000g离心至见底。

2)加入100ul7M盐酸胍（盐酸胍使用50mM碳酸氢铵配），再加入4ul1MDTT（DTT溶于7M盐酸胍），涡旋震荡使蛋白均匀分布于溶液中，震荡后短时低速离心，使溶液处于管的底部，之后55度孵育1小时。

3)加入10ul1M的碘乙酰胺，震荡混匀后低速离心，使溶液处于管底，避光室温放置30min。碘乙酰胺也用7M盐酸胍配。14000g离心至见底。

4)加入100ul50mM碳酸氢铵，14000g离心至见底。重复两次。

5)将超滤管取出置于新的接收管中，加入100ul50mM碳酸氢铵，加入0.2ug/ul的胰蛋白酶25ul。之后旋涡震荡，使蛋白溶液均匀分布，之后短时低速离心至超滤管底部，封口膜封好放置于37℃恒温箱中过夜。

6.1.2仪器条件

1)色谱柱：反相C18，1.6um

2)流动相：A相，0.1%FA水溶液；B相，0.1%FA乙腈溶液；

3)流速：0.2mL/min；

4)柱温：40℃;

5)进样体积：4ul；

6)离子源：ESI

7)检测方式：正离子；

8)MS扫描范围200-2000m/z；

9)MS/MS扫描范围50-2500m/z。

表1色谱分离梯度

时间（min）

A（%）

B（%）

0

100

0

1

98

2

3

时间（min）

A（%）

B（%）

43

70

30

50

50

50

55

20

80

55.5

98

2

60

98

2

6.1.3数据分析

产生的原始数据及图谱由数据分析软件识别标峰并导出对应图谱，通过质谱数据和相关质谱鉴定图谱进行数据库匹配，得出肽段覆盖率鉴定结果。

重组人源化胶原蛋白液质检测总离子流图谱见附录A示图A.1，数据库匹配结果见附录A示图A.2。

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