葡萄酒中褪黑素及其代谢物2-羟基褪黑素、6-羟基褪黑素的测定 高效液相色谱-串联质谱法.docx

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葡萄酒中褪黑素及其代谢物2-羟基褪黑素、6-羟基褪黑素的测定高效液相色谱-串联质谱法

1范围

本文件规定了葡萄酒中褪黑素及其代谢物2-羟基褪黑素、6-羟基褪黑素的高效液相色谱-串联质谱检测方法。

本文件适用于葡萄酒中褪黑素及其代谢物2-羟基褪黑素、6-羟基褪黑素的测定和确证。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法

T/BDAS001-2023牛奶中褪黑素含量的测定液相色谱-串联质谱法

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

试样经N-丙基乙二胺（PSA）净化后，经反相色谱柱分离，以保留时间定性，供高效液相色谱-串联质谱仪测定和确证，外标法定量。

5试剂和材料

本方法所用的试剂，除另有规定外，均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

5.1试剂

5.1.1乙腈：色谱纯。

5.1.2甲酸：优级纯。

5.1.3N-丙基乙二胺（PSA）粉末：粒径。

5.1.40.1%甲酸的乙腈溶液：取0.1mL甲酸用乙腈定容到100mL

5.1.550%乙腈溶液：取50mL乙腈和50mL水混合均匀。

5.2标准品

5.2.1标准品：褪黑素（Melatonin,MT，CAS号73-31-4）、2-羟基褪黑素（2-HydroxyMelatonin，CAS号229018-17-1）、6-羟基褪黑素（6-HydroxyMelatonin，CAS号2208-41-5）。

5.2.2标准储备液（100.0μg/mL）：分别准确称取褪黑素、2-羟基褪黑素、6-羟基褪黑素标准物质适

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量，用甲醇溶解并定容,配制成100.0μg/mL的标准储备溶液，于-20℃避光贮存。

5.2.3混合标准溶液：分别准确吸取褪黑素、2-羟基褪黑素、6-羟基褪黑素标准储备液各1.0mL于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成10.0μg/mL的混合标准储备液于-20℃避光贮存。

5.2.4标准工作溶液：分别准确吸取不同体积混合标准溶液，用50%乙腈溶液定容至1.0mL，配制成褪黑素、2-羟基褪黑素、6-羟基褪黑素的浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0ng/mL的系列标准工作溶液，临用现配。

6仪器和设备

6.1液相色谱-串联质谱仪：配备电喷雾离子源。

6.2天平：感量0.1mg和0.001g。

6.3涡旋混合器。

6.4高速冷冻离心机：最大转速13000r/min。

7分析步骤

7.1试液的提取

吸取2mL（精确至0.01mL）混匀的葡萄酒样品于含有50mgN-丙基乙二胺（PSA）的净化管中，充分涡旋后经10000rpm/min离心5min。移取上清液经0.22μm滤膜过滤后，经高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）进行分析。

7.2仪器参考条件

7.2.1液相色谱参考条件

7.2.1.1色谱柱：C18，2.1×100mm，粒径3.5μm或性能相当。

7.2.1.2柱温：30℃。

7.2.1.3流动相：A：水（含0.1%甲酸），B：乙腈；梯度洗脱见表1。

7.2.1.4流速：0.25mL/min。

7.2.1.5进样量：5μL。

表1流动相及梯度洗脱条件

时间/min

流速/（mL/min）

流动相A/%

流动相B/%

0.00

0.25

90

10

1.00

0.25

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3.00

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7.2.2质谱参考条件

7.2.2.1离子源：电喷雾离子源（ESI）。

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7.2.2.2扫描方式：正离子扫描。

7.2.2.3检测方式：多反应监测（MRM）。

7.2.2.4离子源温度：300℃。

7.2.2.5干燥气流速：7L/min。

7.2.2.6喷嘴电压：45psi

7.2.2.7定性离子对、定量离子对、碰撞能量等参数参见附录A。

7.3定量测定

根据试液中被测物含量情况，选定浓度相近的混合标准使用液，混合标准使用液和待测试液中被测物的响应值均应在仪器