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DB37/T4092—2020

鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术要求

1范围

本标准规定了鱼类肠道微生物样本的采集、分离、培养、鉴定及保藏等。

本标准适用于淡水及海水鱼类肠道微生物的研究。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T30744深海微生物样品前处理技术规范

SN/T2632微生物菌种常规保藏技术规程

3术语与定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

肠道微生物intestinalmicroorganism

生长于动物肠道，并帮助宿主完成多种生理生化功能的微生物群落。

3.2

16SrDNA

是编码16SrRNA的基因，16SrRNA为核糖体RNA的一个亚基，是系统分类研究中最常用的分子标签，可被用于菌种鉴定。

3.3

聚合酶链式反应polymerasechainreaction

一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA/RNA片段，这种方法可在生物体外进行，不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。

3.4

Sanger测序Sangersequencing

即双脱氧链终止法测序，为第一代DNA测序技术，是一种常用的核酸测序技术，用于DNA分析，由英国生物化学家弗雷德里克?桑格于1977年发明。

4缩略语

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下列缩略语适用于本文件。

PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSaline）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

OD：光密度（OpticalDensity）

5基本要求

5.1实验室通用要求

实验室应满足GB19489中关于一级或以上级别生物安全实验室的要求。

5.2鱼类样本要求

鱼类样本应尽量保证鲜活，死亡鱼类样本最长死亡时间不应超过24h。

5.3实验用具准备

一次性无菌手套、无菌眼科镊、无菌眼科剪、无菌PBS（配方见附录A.1）、2216E培养基(配方见附录A.2)、LB培养基（配方见附录A.3）、无菌水、无菌50mL离心管、医用托盘、75%消毒酒精、涂布棒等。

6鱼类肠道微生物样本采集和保存

6.1鱼类肠道微生物样本采集与储存

6.1.1活体鱼类样本应先进行麻醉，之后，在超净工作台内，用75%的酒精对鱼体擦拭消毒。

6.1.2将鱼类样品从泄殖腔处沿腹部剖开，用无菌PBS冲洗鱼类腹部，用吸水纸擦拭腹腔。

6.1.3分离并剪下鱼类完整肠道，将肠道内容物全部挤到无菌离心管中，并将肠道内壁残留物轻刮于离心管中。

6.1.4对肠道内容物进行称重，内容物总质量应控制在10g以下，按1g内容物加入3mL无菌PBS的比例进行稀释，震荡混匀，得到肠道微生物样本。

6.2肠道微生物样本存储

肠道微生物样本应储存在2℃~8℃低温环境下，宜立即进行处理，保存期限不应超过一周。

7鱼类肠道可培养微生物的分离、培养及鉴定

7.1肠道微生物分离和纯化

7.1.1肠道微生物分离

7.1.1.1

取100μL肠道微生物样本，用无菌PBS稀释到1000μL，制成10-1样品稀释液，震荡混匀，

备用。

7.1.1.2

取100μL10-1样品稀释液，用无菌PBS稀释到1000μL，制成10-2样品稀释液，震荡混匀，

备用。

7.1.1.3

按上述步骤依次稀释获得10-3、10-4的样品稀释液，震荡混匀，备用。

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7.1.1.4取10-2，10-3，10-4样品稀释液进行固体培养基平板涂布，涂布平板宜28℃恒温培养，培养时间1～3天，每隔12h观察菌落生长状态。

7.1.2肠道微生物纯化

7.1.2.1观察涂布平板的生长情况及菌落形态特征，选择合适稀释度（约10～200个菌落）的平板挑选菌落，选择不同形态的单菌落编号后划线，于28℃恒温培养12h～24h。

7.1.2.2观察划线培养菌落形态特征是否单一，对于形态结构不单一的平板继续挑单菌落并划线培养，直至获得菌落形态特征一致的纯培养单菌，并填写《菌落形态特征统计表》，参见附录B。

7.2肠道微生物培养

挑取分离、纯化出的纯培养单菌落接种至液体培养基中，宜150rpm28℃条件下恒温震荡培养至菌液OD600值达到0.6～1.0之间。