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对外周血Y染色体AZF微缺失基因检测-病

理学论文-基础医学论文-医学论文

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不育不孕症严重影响到一个家庭的和睦及幸福，随着科技及化工

业的发展，不育不孕症患者越来越多，成为本世纪严重危害人类生殖

健康的疾病之一。

据世界卫生组织（WHO）统计，全世界育龄夫妇约有15%存在

生育问题（WHO1987年），这部分人群中有50%不育与男性因素有关，

而由遗传缺陷因素所引起的生精障碍约占男性不育因素的30%。男性

不育患者中Y染色体长臂无精子症因子（azoos-permiafactor，AZF）

区微缺失被认为是最重要的非梗阻性无精及少精症因素之一，现代分

子生物学和细胞遗传学的研究亦证实了与精子生成相关的AZF基因

存在于Y染色体长臂q11区，目前将Y染色体AZF区分为4个区位，

分别为：AZFa区、AZFb区、AZFc区和AZFd区，其中任何一个区域

座位点的微缺失都可导致生精障碍，造成少精或无精而导致男性不育，

其微缺失引起的男性不育发生率仅次于Klinefelter综合征，并且在进

行辅助生殖技术卵胞质内单精子注射（ICSI）过程中能将这种遗传缺

陷传递给男性下一代，因此在进行ICSI治疗之前进行Y染色体微缺失

检测具有重要的临床及理论意义。

本研究对来我院诊治的332例男性精子异常患者及100名已育男

性进行外周血Y染色体AZF微缺失基因检测，现总结分析报告如下。

1资料与方法

1.1临床资料

病例组：选择2011年7月至2014年1月到我院生殖中心诊治的

不育男性患者（年龄20～46岁），诊断标准：女方检查正常，结婚1

年以上，未采取避孕措施且夫妻生活正常的情况下不能生育的非阻塞

性男性患者，在排除了其他原因如感染等原因后对其进行精液常规分

析，按照WHO精液分析标准分类：精子密度20106/mL者为少精症

患者；患者每间隔7~14d留取精液检测1次，连续3次未发现精子，

进一步离心沉淀也没有发现精子者为无精症患者。对精液分析为异常

的患者进行Y染色体AZF微缺失基因检测；阴性对照：健康女性作为

阴性对照；健康对照组：100名精子密度20106/mL的已婚男性（年

龄20～46岁）为健康对照组。

1.2研究方法

1.2.1研究对象的DNA抽提：用含乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）

抗凝剂的真空管抽取受试者外周血2mL并充分混匀。提取白细胞DNA

的试剂盒为深圳亚能生物技术有限公司提供的全血DNA快速提取试

剂盒。

1.2.2多重聚合酶链反应（PCR）扩增检测：用深圳亚能生物技术

有限公司提供的Y染色体微缺失检测试剂盒，同时检测Y染色体AZF

区域内的以下15个STS序列标鉴位点（sequencetagsite，STS），包括

AZFa区：SY82，SY84，SY86；AZFb区：SY124，SY127，SY143，SY134，

SY128，SY133；AZFc区：SY254，SY255，SY242，SY239；AZFd区：SY152，

SY145。15个序列标鉴位点分成紫、白、蓝、黄4管扩增，详细每管

检测位点及排列位置见表1。每管包括14LPCR反应液，10L去离子水，

1L待测样本DNA，总体积共25L。

设定的扩增程序分为3个步骤：第1个为步骤为50℃10min，

95℃15min；第2个为步骤为94℃30s，58℃60s，72℃60s共34个循环；

第3个步骤为72℃10min。内控对照为Y染色体性别决定区SRY基因，

每次实验均以已育健康男性基因组DNA作为阳性对照，健康女性基

因组DNA作为阴性对照。

1.2.3电泳检测：吸取PCR扩增后产物6L。点样于事先配制好的

2%Biowest进口琼脂糖凝胶孔中，先用电压8V/cm，电泳4~5min使

DNA迁移出上样孔，再将电压调降到5V/cm电泳30~40min，取出琼

脂糖凝胶在凝胶成像系统观察电泳结果。

1.2.4结果判读：℃管，℃管，℃管，℃管分别为健康男性的DNA提

取物分别加入紫、白、蓝、黄4管，Y染色体微缺失检测正常（见图

1）PCR电泳对照结果显示，检测者AZFc+AZFd区缺失，缺失位点分

别是SY152、SY239、