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免疫室乙肝两对半操作规程

一、试验原理

“乙肝两对半”指乙型肝炎病毒表面抗原（HBSAg）、乙型肝炎病

毒表面抗体（HBSAb）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）、乙型肝炎病毒

e抗体（HBeAb）、乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）此五项指标，目

前国内医院最常用的乙肝病毒感染检测血清标志物，判断是否感染乙

肝与粗估病毒复制水平初步检查。两对半中各项试验反应原理如下：

1、乙型肝炎病毒表面抗原检测：

采用ELISA“双抗体夹心法”原理，用抗-HBs包被板条，用HRP

标记抗-HBs为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB）和过氧化物为底

物。当标本中存在HBSAg时，该表面抗原与包被抗-HBs结合并与抗

-HBs-HRP结合形成抗-HBs-HBSAg-抗-HBs-HRP复合物，加入TMB底物

产生显色反应，反之则无显色反应。在试验结束时，有颜色变化的，

提示有HBSAg存在，无颜色或颜色变化微弱的，则提示不存在HBSAg。

2、乙型肝炎病毒表面抗体检测：

采用ELISA“双抗原夹心法”检测人血清或血浆中的抗-HBS,采

用HBSAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBSAg-HRP进行孵育。

当标本中存在抗-HBS时，该抗体与包被的HBSAg结合并与酶结合物

形成HBSAg-抗-HBS-HBSAg-HRP复合物，洗去游离反应物，加入显色

剂，将有明显颜色变化；当标本中没有抗-HBS时，加入底物后没有

或只有很轻微的颜色变化。

3、乙型肝炎病毒e抗原检测：

采用ELISA“双抗体夹心法”检测，用单抗-HBe包被板条，用

HRP标记抗-HBe为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB）和过氧化物为

底物。当标本中存在HBeAg时，该HBeAg与包被抗-HBe结合并与抗

-HBe-HRP结合形成抗-HBe-HBeAg-抗-HBe-HRP复合物，加入TMB底物

产生显色反应，反之则无显色反应。在试验结束时，有颜色变化的，

提示有HBeAg存在，无颜色或颜色变化微弱的，则提示不存在HBeAg。

4、乙型肝炎病毒e抗体检测：

采用LEISA“中和竞争法”检测抗-HBe，用单抗-HBe包被板条，

用HRP标记的多抗-HBe为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB）和过氧

化物为底物。加入待测的标本，同时加入基因工程HBeAg和多抗

-HBe-HRP,当标本中抗-HBe含量高时，则抗-HBe-HRP与HBeAg结合后

形成游离物被洗涤掉，加入TMB底物时显色淡，反之则显色深。在试

验结束时，无颜色或颜色变化微弱的，提示有抗-HBe存在，显色深

时，则提示不存在抗-HBe。

5、乙型肝炎病毒核心抗体检测：

采用ELISA“竞争抑制法”检测抗-HBc，用基因工程重组HBcAg

包被板条，用HRP标记的抗-HBc为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB）

和过氧化物为底物。加入待测标本，同时加入抗-HBc-HRP,与抗原形

成竞争结合，当标本中抗-HBc含量高时，则抗-HBc-HRP与HBcAg结

合少，加入TMB底物时显色淡，反之显色深。在试验结束时，无颜色

或颜色变化微弱的，提示有抗-HBc存在，显色深时，则提示不存在

抗-HBc。

二、样本要求

1、无需空腹，可血清或血浆标本；新鲜标本无菌冷藏１周可用；

可冷冻保存，但避免反复冻融。样品中含叠氮钠会影响结果；高

度溶血或没完全收缩的血清样品或有微生物污染的样品可能会

引起错误的结果。

2、试剂：我室“乙肝两对半”检测试剂盒由上海荣盛生物药业有

限公司提供

3、设备：洗板机1台、酶标仪1台、微量振荡器1台、打印机1

台、加样器1把、吸嘴（50-250ul）

三、操作步骤

1、试剂盒准备

试剂贮存在2-8℃冰箱，实验前应提前30min取出，使其恢复至

室温，待用。

2、加样

（1）准备实验所需反应孔在以上实验原理中可以看出“乙

肝五项”中每个项目必须对应各自反应孔，不可错位摆放，否

则直接导致错误报告发出。

（2）乙肝表面抗原：第一步，先加样本100ul，温