细胞工程之核移植技术与动物克隆.ppt

卵母细胞的来源：用激素对雌体进行超排处理，从输卵管冲出体内成熟的MII卵母细胞。从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)，在体外培养成熟后作为受体。冷冻保存的卵母细胞(1)核受体细胞的准备21第21页,共40页，星期六，2024年，5月卵母细胞的去核处理：(1)核受体细胞的准备22将MII卵母细胞置于含细胞松弛素(5-7.5ug/mL)的培养液处理10-20min.显微镜下以持卵管吸住卵母细胞.以尖端去核针刺穿透明带，吸出第一极体和极体下1/3胞质.第22页,共40页，星期六，2024年，5月供体细胞核具备的条件：必须是完整的二倍体，保持有供体动物完整的基因组供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生细胞分化过程的逆转，能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。(2)核供体细胞的准备23第23页,共40页，星期六，2024年，5月供体细胞类型：胚胎卵裂球细胞体细胞胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞(2)核供体细胞的准备24第24页,共40页，星期六，2024年，5月(3)细胞核移植胞质内注射透明带下注射25胞质内注射是用一个外径5～8μm的注核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合第25页,共40页，星期六，2024年，5月固定针对准极体部位，将卵母细胞固定，去核微吸管对准极体插入透明带，将极体和部分细胞质吸入吸管中26第26页,共40页，星期六，2024年，5月吸管拉出时，细胞膜被拉长形成一个桥，吸管脱离透明带，质膜被掐断，挤推出管中的极体和细胞质27第27页,共40页，星期六，2024年，5月体外受精卵形成的8细胞牛胚胎经透明质酸处理后，分离出8枚分裂球，吸取细胞核28第28页,共40页，星期六，2024年，5月将胚胎细胞的细胞核移入去核卵母细胞的透明带中29第29页,共40页，星期六，2024年，5月(4)激活受精引起的卵母细胞激活人工的激活激活是胚胎发育所必需的人工激活:30是通过电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从MII期中解放出来，并转到“受精”的状态瞬时直流电脉冲激活化学试剂激活：Ca2+载体、乙醇、SrCl2、放线菌酮、离子霉素人工激活的手段:第30页,共40页，星期六，2024年，5月(5)重组胚的体内或体外培养核移植胚的体内培养：一般植入输卵管4-7d，发育到桑椹胚或囊胚，如牛、羊、猪核移植胚的体外培养：体外培养基培养，发育到桑椹胚或囊胚，如大鼠、小鼠、兔31第31页,共40页，星期六，2024年，5月(6)胚胎移植受体母畜的选择：皮毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强、体格稍大的当地品种移植部位：输卵管、子宫角移植方法：同期发情处理常规法移植32第32页,共40页，星期六，2024年，5月第2节核移植技术的应用33第33页,共40页，星期六，2024年，5月二、核移植技术的应用1．制备转基因克隆动物，?进行生物药物生产2．培育优良畜种，扩大良种种群3．开展异种动物克隆，拯救濒危动物转基因克隆山羊生产：抗凝血因子III转基因克隆羊、牛生产：a-1-抗胰蛋白酶转基因克隆牛生产：胶原蛋白转基因克隆猪生产：人生长激素培育品系更纯的实验动物培养优质畜种培育种间杂交动物，用于育种用兔卵母细胞获得大熊猫早期胚胎34第34页,共40页，星期六，2024年，5月二、核移植技术的应用4．与干细胞技术结合，开展治疗性克隆治疗性克隆***(Therapeuticcloning)利用核移植技术与转基因和胚胎干细胞等生物技术结合，体外培养所需细胞、组织器官、以替代或修补患者损伤或患病的细胞、组织、器官的过程运用举例：患者体细胞去核人卵母细胞重组胚囊胚ES细胞定向分化多巴胺神经元帕金森病胰岛细胞糖尿病肝细胞肝纤维化CD4+T细胞艾滋病35第35页,共40页，星期六，2024年，5月二、核移植技术的应用5．利用核移植技术，研究生物学的基本问题细胞分化基因调控核质关系基因组印记36第36页,共40页，星期六，2024