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分子生物学实验指导

生物技术教学室编

宁夏大学生命科学学院

2008年8月

实验一分子生物学实验技术多媒体演示

[目的要求]

通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。

[教学方式]

多媒体光盘演示。

[实验内容]

基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。

实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA

[目的要求]

通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术

[实验原理]

琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidumbromide,EB），在紫外光下可以检出10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。

琼脂糖凝胶有如下特点：

(1)DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。

(2)琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。

(3)电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。

(4)电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在

(5)嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。

(6)离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。

对于天然的双链，常用的几种电泳缓冲液有TAE、TBE等，一般配制成浓缩母液，室温保存，用时稀释。

[实验仪器与设备]

1.恒温培养箱2.琼脂糖凝胶电泳系统

3.高压灭菌锅4.紫外线透射仪

[实验材料]

1.三羟甲基氨基甲烷（Tris）2.硼酸

3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.溴酚蓝

5.蔗糖6.琼脂糖

7.溴化乙锭8.DNAmarker

9.DNA样品

[实验步骤]

1.缓冲液的配制

5×TBE(5倍体积的TBE贮存液)

配1000mL5×TBE:

Tris54g

硼酸27.5g

0.5mol/lEDTA20mL

Ph8.0

凝胶加样缓冲液(6×)

溴酚蓝0.25%

蔗糖40%

③溴化乙锭溶液(EB)0.5μg/mL

2.制备琼脂糖凝胶

按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：

琼脂糖凝胶浓度线性DNA的有效分离范围

0.3%5-60kb

0.6%1-20kb

0.7%0.8-10kb

0.9%0.5-7kb

1.2%0.4-6kb

1.5%0.2-4kb

2.0%