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向日葵主要种传病原真菌室内检测技术规程

1范围

本文件规定了向日葵种子携带真菌的室内检测和鉴定技术。

本文件适用于室内进行向日葵种子带黄萎病、枯萎病和黑斑病病原菌的检测。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4向日葵种子样本

用于检测的向日葵种子来自市场上销售的不同向日葵品种。每个向日葵品种随机取100粒种子。

5向日葵种子带真菌率的检测与鉴定

5.1向日葵种子真菌带菌率的检测

每一个向日葵品种随机选择100粒饱满的种子。将种子外壳剥去，取出籽仁，将籽仁放入蒸溜水中浸泡24h，用镊子剥下种皮。种皮用70%乙醇浸泡1min，然后用无菌水漂洗两次，每次1min。将种皮放置在灭菌的滤纸上晾干后，放在新鲜制备的MNP-10选择性培养基（见附录A）进行培养，培养条件为24℃±2℃,每皿放置10个种皮。待种皮周围出现菌落后，计数菌落的数量，统计种子带菌率。计算方式见公式（1）。

X=（A/B）×100%………………（1）

式中：

X——种子带菌率；

A——带菌的种子数；

B——供试的种子总数。

5.2种皮携带真菌的形态学鉴定

将菌落转移到新的PDA培养基上后，利用稀释梯度法进行单孢纯化。对纯化后菌株的菌落形态进行观察并在显微镜下进行初步的形态学鉴定。

向日葵黄萎病病、向日葵枯萎病及向日葵黑斑病病原菌特征见附录B、附录C、附录D。

5.3种皮携带真菌的分子生物学鉴定

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将在PDA平板培养基上扩繁的真菌的菌落用盖玻片刮下，转入2mL的离心管中，然后采用CTAB方法提取菌株的DNA，利用提取的DNA作为模板进行PCR鉴定，引物为ITS1和ITS4。

引物信息：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

PCR程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。

取5.0μLPCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测，剩余的PCR产物用于测序分析。PCR产物测序后获得的序列在Genbank进行比对，比对结果中同源性达到99%以上的就可以确定种皮上携带真菌的种名。

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附录A

（资料性）

MNP-10培养基配方（500ml）

MNP-10培养基配方见表A.1。

表A.1为MNP-10培养基配方

配方组成

灭菌方法

Part1

PGA5.0g，NaOH4.0g

121℃,15min

Part2

KNO31.0g，KH2PO41.0g，KCL0.5g，MgSO4.7H2O0.5g，Tergitol0.5ml，琼脂粉15.0g

121℃,15min

Part3

氯霉素25mg，链霉素25mg，金霉素25mg

过滤灭菌

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附录B

（资料性）

向日葵黄萎病病原菌形态

大丽轮枝孢菌是引起向日葵黄萎病的主要真菌。大丽轮枝孢菌的菌体初期无色，老熟后变为褐色，有隔膜。菌丝上生长直立无色的轮状分生孢子梗，一般为2～4轮生，每轮着生3～5个小枝，多者为7枝，呈辐射状。分生孢子梗长110μm～130μm，无色纤细,基部略膨大呈轮状分枝，分枝大小13.7μm～21.4μm×2.3μm～9.1μm。分生孢子一般着生在分生孢子梗的顶枝和分枝顶端，分生孢子长卵圆形，单孢子，无色或微黄，纤细基部略膨大，大小2.3μm～9.1μm×1.5μm～3.0μm。当条件不适合时，菌丝体细胞壁加厚成为串状黑褐色的厚垣饱子(扁圆型)或膨胀成为瘤状的黑色微菌核，大小30μm～50μm，近球形或长条形（见图B.1）。

图B.1大丽轮枝孢菌菌落、分生孢子梗和分生孢子以及微菌核形态