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医学生pcr实验室实验报告

实验目的

1、了解PCR技术，掌握最基础的PCR实验步骤

实验原理

1、PCR全称聚合酶链反应，是体外快速扩增特定基因或DNA序列

最常用的方法。

2、基本原理：首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离

成2条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混

合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的DNA互补链。PCR反应时，只

要在试管内加入模板DNA、PCR引物、四种核苷酸及适当浓度的Mg2+，

DNA聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增100万倍以上。

实验内容

PCRMIX5ul、F上游引物1ul、R下游引物1ul、模板DNA1ul、

H202ul

共10ul

注意事项

1、戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套。

2、使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不

要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。

3、避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心

收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀

酸擦拭桌面。

4、操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物

和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加

反应的精确度。

5、最后加入反应模板，加入后盖紧反应管。

6、操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠

性，又可以协助判断扩增系统的可信性。

7、尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产

物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。

如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不

能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区。

8、重复实验，验证结果，慎下结论。

实验步骤：

首先取出所需要的DNA试剂放于ep管盒中

将引物与mix放置于带冰的盒中。利用mix和所需要引物及水配置

mismis组成：320ulmix64ul上游引物64ul下游引物和64ul的水配置过

程中一定要选择正确的引物，否则会对实验结果造成影响

Pcr所需要的反应体系为20ul所以可以适当的多配一点避免样品量

不够。

在制成mis液后，要先进行离心处理再加入ep管中。

每个反应的ep管中，mis液为16ul，而另外4ul为样品DNA液。

TaqMastermix10XXXX，上游引物2XXXXI，下游引物2XXXXXI，

ddH202XXXXI，DMA

（鼠尾）4xxXXXX1加完DNA后，做好标记，拍照，避免对以后

的实验造成影响。

下午；在pcr房中进行pcr先离心再放到pcr仪中，尽量往中间放，

仪器不要拧太紧。

按照设定好的程序跑pcr，选择C2g文档，***

将样液最好置于pcr仪的中间部分加热。在pcr结束前40分钟进行

凝胶配置。

取出琼脂糖，称量2g，取出TEA，EB管，maker等到公共房中进

行配胶将锥形瓶先进行洗净，加热处理。。

将琼脂糖倒入锥形瓶中，加入100-150ml的TEA，搅拌，溶解后放

入微波炉中加热。

观察溶液体积，直到体积浓缩到100ml，带上隔热手套将其取出。

往锥形瓶中加入EB溶液10ul，在加入的过程中，注意EB管与操

作人的距离，注意管中的液体不要洒出，该液体具有强烈的致癌性，千

万注意。

混匀后，将溶液沿着角倒入模具中，缓慢匀速倒入，不要将液体全

部倒入，要留存部分液体。冷却半个小时

若模具中存在气泡，要将气泡赶到角落中，避免影响实验结果。拿

出梳子，取出凝胶，置于电解液中，电解液要全部侵泡凝胶。

再取出凝胶，第一个孔某某maker，后八个孔某某样品液。之后每

隔八个加一次maker，注意间距的把握。

每个孔某某的样品液是7ul，而每次7ul取maker时，所用的maker

要加俩个孔，避免马克瑞过多而溢出。

在150v的电场条件下进行电泳，电泳时间大约为半个小