胚胎干细胞培养标准化操作规程(SOP).pdf

一、细胞

多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡

1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由Dr.Nagy的实验室制备。

2．D3-ATCC;CRL-1934.我们得到时大约传了17代。

3．J1-由Dr.Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。

4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr.Jaenish的实验室友情提供。

5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr.Nagy的实验室提供。

二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态

ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提

供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的

平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿

之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而

将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。

培养基

ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分

装在50mlFALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS

和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM

是500ml。

贮存液

DMEM(高糖)

马血清（HS）

L-谷氨酰胺（200mM）

MEMNEAA（10mM）

HEPES（1M）

β-巯基乙醇（55Mm）

PEST

ESGRO

复苏细胞

细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，

二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤

1．从液氮中取出一管细胞；

2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；

3．将细胞转移到一15mlFalcon管中；

4．加入5mlES培养基（用培养基冲洗冻存管）；

5．离心3分钟；

6．弃上清，用2mlES培养基重悬细胞，至少吹打10次；

7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；

8．孵育。

冻存细胞

冻存液：90％HS和10％二甲基亚砜

步骤：

1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；

2．用细胞刮刀收集细胞；

3．将细胞转入15mlFalcon管内并离心3分钟；

4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6～

7ml。）

5．分装于冻存管内，每管1ml；

6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。

明胶包被

准备500ml0.1％明胶溶液

1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。

2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。

包被培养板或培养皿

1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0.5～1ml，溶

液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了）；

2．置室温30分钟；

3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平方，以免明胶污

染盖子和流出培养板。

细胞传代

建议每2－3天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种

纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附

在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。

1．去除培养液；

2．1×无钙镁PBS洗涤；

3．加入1×胰酶EDTA(10×胰酶EDTA用PBS稀释。)37℃孵育5分钟。

4．加入ES培养基使胰酶失活；

5．将细胞转入15ml离心管中离心3min；

6．去除上清，将细胞重悬于2mlES培养基，至少吹打10－20次。

如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，

传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。