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结核分支杆菌（TB）核酸检测标准操作规程

1.目的：规范结核分支杆菌（TB）核酸检测操作流程，保证检测结果的准确性。

2.应用范围：PCR实验室。

3.职责：

3.1文件编写：PCR实验室技术员。

3.2文件审核：PCR实验室负责人。

3.3文件审批：实验室主任。

3.4执行：PCR实验室所有工作人员。

4.参考文献：

4.1《中山大学达安基因股份有限公司结核分支杆菌核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒说明书》

4.2《中山大学达安基因股份有限公司DA7600核酸序列检测系统用户手册》

5.内容：

5.1检测方法：PCR-荧光探针法。

5.2实验原理：

用一对结核分支杆菌(TB)特异性引物和一条结核分支杆菌(TB)特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐

热DNA聚合酶（Taq酶）、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即高温变性、低温退火、

适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而检测结核分支杆菌核酸。主要用于TB感染的辅

助诊断及其疗效监测的标准。

5.3性能参数：

2

5.3.1检测下限：5.0×10基因拷贝/ml。

28

5.3.2线性范围：5.0×10～5.0×10基因拷贝/ml。

5.4标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。

5.4.1标本类型：痰液、肺及支气管灌洗液、尿液等。

5.4.1.1痰液：清晨从肺深部咳出痰液，取1～3ml置于无菌玻璃管内，密封送检；婴幼儿用密闭容器与

无菌吸痰器相连，吸取痰液，密封送检。

5.4.1.2肺及支气管灌洗液：收集灌洗液1～3ml置于无菌玻璃管内，密封送检；

5.4.1.3尿液：用无菌5ml玻璃管收集中段尿1～3ml，密封送检。

5.4.2标本保存：标本采集后保存于2～8℃。

5.4.3运送条件：标本运送采用冰壶。

5.5设备和试剂：

5.5.1设备：DA7600荧光定量PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、

恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。

5.5.2试剂：

5.5.2.1试剂品牌：《中山大学达安基因股份有限公司结结核分支杆菌核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒》

5.5.2.2试剂批准文号：国食药监械（准）字2011第3400392号

5.5.2.3试剂组成：DNA提取液（500μL/管）2管；TB-PCR反应管（未贴标签管）20人份；TB临界阳

性质控品（50μL/管）1管；TB强阳性质控品（50μL/管）1管；阴性质控品（250μL/管）1管。

5.5.2.4试剂包装规格：单管单人份，20人份/盒。

5.5.2.5试剂保存和有效期：保存于-20℃；有效期6个月。

5.6操作过程：

5.6.1标本与质控品的处理：

5.6.1.1打开恒温水浴槽或加热器，设定温度100℃。

5.6.1.2从试剂盒中取出DNA提取液、阴性质控品和阳性质控品，让其在室温下完全融化。

5.6.1.3痰液标本的处理：

5.6.1.3.1于痰液中加入4倍体积的4%NaOH，摇匀，室温放置30分钟待液化；

5.6.1.3.2用枪头或吸管混匀后吸取1ml液体至1.5ml离心管中，12,000rpm离心5min；

5.6.1.3.3去上清，向沉淀中加入灭菌生理盐水1ml，混匀，12,000rpm离心5min；

5.6.1.3.4去上清，向沉淀中加入50μLDNA提取液，充分混匀，100℃恒温处理10±1min，12,000rpm离

心5min，备用。

5.6.1.4肺及支气管灌洗液、尿液的处理：

5.6.1.4.1取灌洗液或尿液1.0ml至1.5ml离心管，12,000rpm离心5min；

5.6.1.4.2去上清，向沉淀中加入灭菌生理盐水1ml，混匀，12,000rpm离心5min；

5.6.1.4.3去上清，向沉淀中加入50μLDNA提取液，充分混匀，100℃恒温处理10±1min，12,000rpm离

心5min，备用。

5.6.2排版：在DA7600荧光定量扩增仪的上机面板表里设置面板。

5.6.3加样：从-20℃冰箱取出TB-PCR反应管若干管转移至加样区，根据上机面板的位置放好后，直接加

入处理好的样本DNA和阴性质控、阳性质控品各5μL，2,500rpm