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新冠核酸检测无内参原因

大家在做新冠核酸检测的时候经常会碰到一个问题：某个反应孔

的内参没有曲线，甚至整板的内参都不起，往往这时大家第一个想到

的就是标本不合格，需要重新采样，其实不然，内参基因无扩增曲线

的原因有很多，需要具体情况具体分析。

首先，我们先要搞明白什么是内参？新冠核酸检测中的内参分为

两种，一种是内源性内参，另一种是外源性内参。

内源性内参其实就是人体组织和细胞中表达比较恒定的管家基

因，常用的管家基因包括GAPDH、BETA-actin、18sRNA、B2M、HPRT

和TBP等。内源性内参可以监测标本的采集、检测、扩增等各个环

节。因此，内源性内参的应用比较广泛。

外源性内参，是一种人工设计合成的与模板扩增效率相似的基因

片段，需要额外加到提取溶液中，外源性内参由于是人工设计的基因

片段，其扩增效率与靶基因相近，因此能够更好地反应核酸提取及扩

增的过程。

在搞清楚上述两个概念之后，我们再来分析一下新冠核酸检测中

无内参的原因：

01标本采集的原因

标本采集不合格可能会导致内参基因无扩增曲线，原因在于未

采集到足够的细胞，核酸提取后内参基因片段极少，导致内参基因无

法正常扩增。

但是，当下应检尽检、愿检尽检所使用的采样管通常是10合

1或20合1的采样管，这种情况下，因标本采集不合格引起内源

性内标无扩增曲线的情况极为少见。

应当注意的是，当样本的内源性内参基因的扩增曲线Ct值偏

大，或者曲线较早地进入平台期时，都要引起注意。前者可能是由于

采集的样本中细胞较少造成的，后者提示样本中可能存在抑制物，抑

制PCR的反应。

在这需要说明的是外源性内参只参与提取和扩增的过程，不能检

测标本的采集，这也是外源性内参的一大缺点。

02核酸提取的原因

由于现在要求核酸检测结果要及时发布，很多厂家不仅缩短了核

酸的扩增时间，提取的程序也大大缩短，通常磁珠法提取在30~

40分钟，目前很多厂家都能做到10~20分钟，但是，更快的提取

速度，并不能保证提取的质量。

曾在试验中发现，使用某种更快的磁珠法提取程序，会导致部分

样本的内参基因无扩增曲线，对比两种不同时间的程序发现，更快的

提取程序，磁珠与样本的孵育时间缩短，推测可能导致样本中的核酸

与磁珠结合较少，导致部分样本内参无扩增曲线或扩增曲线Ct值偏

大。

因此，建议实验室在更换更快的提取程序时，做好性能验证或性

能确认试验，以验证该程序是否能在本实验室检测系统中达到国家要

求的检测限。

03扩增试剂的原因

扩增试剂在引起检测结果无内参的原因主要有以下两方面：

未达到要求的反应体系，PCR反应体系要求比较严格，我们可以

了解一下PCR的标准反应体系：例如100uL的PCR反应液各成分

的浓度要求：①4种dNTP混合物各200umol/L；②引物各10

~100pmol；③模板DNA0.1～2ug；④TaqDNA聚合酶2.5U；⑤

Mg2+1.5mmol/L。

可以想象，在20~50uL的反应体系下，多加2uL或少加

2uL，反应液中反应物质的浓度会有较大的变化，因此，可能导致反

应不能正常进行。

扩增试剂的长时间高温放置会导致检测结果异常，扩增试剂要求

的保存温度通常是-15℃至-25℃，反复地冻融可能会导致酶

的失活或者或者探针的降解，导致反应不能正常进行。另外，同种试

剂的不同批号最好不要混合使用。

04人的因素

检验五大要素「人、机、料、法、环」中，人的因素排在第一位，

在导致核酸检测内参基因无曲线的原因中，人的因素主要表现在一下

几个方面：