基于高原低氧适应性的藏鸡胚胎Hb分子表达分析.docxVIP

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基于高原低氧适应性的藏鸡胚胎Hb分子表达分析

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李倩

摘要：藏鸡具有良好的克服低氧损害、低氧适应性能力。基于鸡红细胞生成与珠蛋白表达分析，选择403只隐性白鸡、111只藏鸡为样品，低氧环境分别选择为13%氧含量、12%氧含量，采取全期低氧、阶段性低氧模式，对上述2个品种鸡的血红蛋白突变、位点等进行实验分析。结果表明：藏鸡对低氧适应能力较强，在低氧环境诱导下，藏鸡胚胎的珠蛋白量增加。

关键词：高原低氧适应性;藏鸡胚胎;Hb分子

：S831.2：B：1673-1085（2021）7-0018-04

藏鸡是青藏高原地区特有的原始鸡种，多分布于海拔高度为2200～4100m的区域[1]。因藏鸡生长过程中，长期面对低氧环境，所以藏鸡在其机体、生理等方面构建了较强的适应能力机制。据此，本实验以鸡红细胞生成与珠蛋白表达为切入点，选取藏鸡、隐性白鸡2个鸡品种的胚胎进行低氧环境试验，以进一步探讨藏鸡高原低氧适应的Hb（Hemoglobin，血红蛋白）分子机制。

1鸡红细胞生成与珠蛋白表达

脊椎动物的造血位点根据造血干细胞群的变化而变化;哺乳动物的造血位点顺序为卵黄囊、胎儿肝脏、脾、成年骨髓。但鸡不以胎儿肝脏为造血器官，在骨髓形成前，在卵黄囊、肠系膜中生成血细胞。具体而言，鸡胚胎在发育的第3～5天，造血位点在主动脉的腹壁上;第6～8天，造血祖细胞在叶间细胞中分部[1]。

在鸡胚胎发育过程中，α族、β族珠蛋白受到严格调控，胚胎发育早期，π、ρ、ε珠蛋白基因表达，其他基因沉默;胚胎发育后期，珠蛋白表达方式与胚胎发育早期的珠蛋白表达相反[2]。基于高原低氧环境，鸡胚胎在不同发育阶段的表达是否能够表现出适应性调控，需要对藏鸡胚胎的高原低氧适应性的Hb分子机制进行探讨。

2材料与方法

2.1样品来源与低氧孵化模拟

2.1.1样品来源实验鸡选择隐性白鸡（白羽肉鸡）和藏鸡，隐性白鸡的种蛋来源于中国农大种鸡场，共计403个;藏鸡的种蛋来源两个群体，35个来自中国农大种鸡场，76个来自西藏不同海拔地區的混合群体。

2.1.2低氧孵化模拟孵化全程采用低氧、阶段低氧两种方式进行，对隐性白鸡、藏鸡种蛋进行同时孵化，低氧孵化时的氧气浓度为13%、12%，温度控制为37.5℃左右，湿度控制在61%左右，翻蛋次数为1次/2h[2]。同时，低氧环境下，不对种蛋进行开箱照蛋处理，21d后，鉴定鸡胚胎死亡日龄。全程低氧环境下藏鸡种蛋数为76个，隐性白鸡种蛋数为233个;阶段低氧环境下藏鸡种蛋数为119个，隐性白鸡种蛋数为152个。

2.2溶液制备

溶液制备包括：0.5MEDTA试剂、50×TAE缓冲液、10×TBE缓冲液等;RNA提取试剂包括：0.1%的DEPC处理水、70%与75%的乙醇、水饱和酶等[2]。

2.3血氧饱和度测定

第14天时，对鸡胚胎进行采血测验，血液采自尿囊静脉，采血时间控制在5min内，并应用肝素钠抗凝。

基于SWISS-MODEL蛋白预测服务器完成突变血红蛋白三级与四级结构的预测，并对血氧饱和度数据、珠蛋白表达数据进行分析[2]。

3结果与分析

3.1根据全期低氧的试验分析

总结出76个藏鸡和233个隐性白鸡的种蛋在氧气浓度为13%环境下死亡个数、孵化个数（21d）;35个藏鸡和170个只隐性白鸡的种蛋在氧气浓度为12%的环境下的死亡个数、孵化个数（21d），具体如表1所示。

为保证实验的可靠性，各阶段的藏鸡、隐性白鸡的种鸡数量设置有所不同，藏鸡、隐性白鸡胚胎在氧气浓度为12%的环境下的阶段存活率、孵化率（21d）具体如表2所示。

从表1、表2分析可知，海拔越高，隐性白鸡比藏鸡的死亡幅度越大，低氧耐受能力越差。在全期低氧环境下，13%的氧气浓度下隐性白鸡的孵化率为3.1%;12%的氧气浓度下，藏鸡也无法适应，孵化率只有11.3%。同时，根据卡方独立性检验，各阶段与品种因素内各水平间不显著（P0.05）;而孵化率方面，不同品种间差异显著，但低氧阶段间差异不显著（P0.05）[2-3]。

3.2Hb突变位点检测

针对存活的隐性白鸡、藏鸡的血红蛋白突变位点进行检测，隐性白鸡中未检测到突变，藏鸡α链存在突变Met-32D（B13）-Leu[4]。通过对其蛋白质序列分析，预测其血红蛋白的三维结构。图1为藏鸡血红蛋白β珠蛋白的突变及其相邻氨基酸示意图;图2为接触点位示意图;图3为藏鸡血红蛋白阶段表达谱示意图。

由图2分析可知，藏鸡的两个血红蛋白接触位点的两个氨基酸之间的距离，根据范德华力作用距离，该突变产生较弱的范德华力作用，突变位点Ile-55H（D6）-Leu处于同一螺旋的突变Ala-51H（D2）-Pro发生于分子表面，未发生新的分子作用力变化。

从图3可以看出鸡胚中有7种血红蛋白（HbA、HbD