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【资料】分子生物学常见问题解答

1、基因组DNA的得率较低或者无基因组DNA原因，如何解决？

1)样品材料老化或者反复冻融导致DNA含量下降：应选择新鲜的材料样品，如新鲜血液、

新鲜菌液、刚离体的动物组织或幼嫩的植物组织等，不能立即处理的样品应放入液氮或-70℃

低温保存，以免DNA降解。

2)样品破壁或者裂解不完全，DNA未充分释放：动植物样品应在液氮中充分研磨，G+细

菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械方法协助破壁。

3)样品过多导致细胞裂解不充分：加样过多导致细胞裂解不充分，细胞裂解不充分。

4)DNA吸附不均匀：如在上吸附柱前没有加无水乙醇，或使用低浓度乙醇代替无水乙醇，

会导致DNA不能充分沉淀，与硅胶模吸附不彻底，因此应在样品裂解后加适量的无水乙醇，

再上吸附柱使DNA与硅胶模充分吸附。

5)DNA洗脱不适当：洗脱缓冲液pH过低会阻碍DNA从硅胶模上洗脱下来，应确保洗脱

液pH值在7.0-8.5之间。洗脱液体积过少（30μl），不易浸透硅胶模，使DNA不能洗脱下

来，因此洗脱液体积应大于30μl，超过200μl，所得的DNA浓度降低。洗脱时可以将洗脱

液于65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率，加大DNA产

量。

2、基因组DNA质量测定的问题分析。

采用分光分度测定时OD260/OD280比值1.8，说明大量RNA残留，没有使用RNaseA，

或RNaseA活性下降。

3、提取的基因组DNA有降解，如何解决？

选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或未低温保存：陈旧血液或不新鲜的

材料中，细胞凋亡导致DNA降解，或者低温保存的样品经反复冻融导致细胞破碎，内源性

核酸酶降解DNA，因此应该选用新鲜的材料样品，不能及时处理则低温保存，运输过程中

应该使用干冰。

1)未能有效的抑制内源性核酸酶的作用：某些DNase含量丰富的动植物组织样品应在液氮

中研磨或匀浆，研磨过称中随时补充液氮，并在样品未完全解冻之前加入含有抑制核酸酶作

用的裂解液。

2)操作过于剧烈导致DNA被机械打断：预处理的样品应该加入细胞裂解以后，所有操作应

该尽量柔和，避免剧烈振荡。

4、提取的基因组DNA不能顺利的进行后继实验，如何解决？

得到的基因组在进行常规下游实验如PCR、酶切、分子杂交等生物学实验时如不能顺利进

行，主要原因为DNA样品不纯，含有蛋白、有机溶剂和盐类等杂质影响内切酶或DNA聚

合酶的活性：

1)样品过多导致细胞裂解不充分：裂解液不能有效与样品混合，导致裂解不彻底，残留大

量蛋白、多糖、脂类等杂质，为后继的上吸附柱分离纯化造成影响。

2)DNA洗脱前，有大量乙醇残留：有机溶剂乙醇可严重的抑制内切酶、DNA聚合酶的活

性，而在DNA过柱洗涤过程中均使用含有乙醇的去蛋白液和漂洗液，因此在洗脱DNA前，

一定要充分去除残留的乙醇，再加洗脱液。

5、提取的基因组DNA有RNA污染，如何解决？

得到的基因组在进行常规下游实验如PCR、酶切、分子杂交等生物学实验时如不能顺利进

行，主要因为DNA样品不纯，含有蛋白、有机溶剂和盐类等杂质影响内切酶或DNA聚合

酶的活性。

1)实验过程中没有有效使用RNaseA，应严格按照实验要求进行。

2)RNaseA失活：RNaseA应该于-20℃下保存，低温保存时RNaseA比较稳定，不易失活，

但是反复冻融会影响其活性。

6、未提出质粒或质粒得率较低原因？

1)大肠杆菌老化：请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

2)质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功

能的高拷贝数载体。

3)菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质