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蛋白质分析方法

1、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法

样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经

强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品

之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：

NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)

2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4(2)

(NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3(3)

反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。

为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸

溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。

计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白

氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。

评价：

总氮-非蛋白氮=蛋白质氮——蛋白质含量

灵敏度低，误差大，耗时长。

2、双缩脲法（Biuret法）

（一）实验原理

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的

产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个

酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲

反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用

来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris

缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的

缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

（二）试剂与器材

1.试剂：

（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml

的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准

蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配

制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NNaOH

配制。

（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4•5H2O）和6.0克酒石酸钾钠

（KNaC4H4O6•4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10%NaOH溶液，

用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存

瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

2.器材：

可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

（三）操作方法

1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升

的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室

温（20～25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支

试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标

绘制标准曲线。

2、样品的测定：取2～3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注

意样品浓度不要超过10mg/ml。

评价：采用540nm分光光度法测定。测定快速，但是灵敏度差，不精确。

3、Folin—酚试剂法（Lowry法）

（一）实验原理

这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙

的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理

与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而

提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质

中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸