基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现课件.pptVIP

基于微阵列的嗅黏膜中高表达基因的发现课件.ppt

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;实验目的:获得在嗅黏膜中组织特异性基因表达的全局观。

;;MATERIALSANDMETHODS:

1、Animals,tissuesamples,andRNApreparation

2、Fluorescentprobepreparationandmicroarrayhybridization

3、Dateanalyses

4、confirmatorytest

5、Identi?cationofcis-elementsincoordinatelyexpressedgenes

;组织来源:

成鼠的嗅黏膜(OM)、嗅球(olfactorybulb)、鼻呼吸道黏膜(nasalrespiratorymucosa)组织取自6-8周龄的C57BL/6雌性小鼠。

Theethmoidturbinatesandcaudalone-thirdofthenasalseptumservedasthesourceofOMRNA,andthenasoturbinates,maxillo-turbinates,andanteriortwo-thirdsofthenasalseptumwerethesourceofrespiratorymucosalRNA.

Othertissuesincludingmulti-plebrainsubregions,dorsalrootganglion,heart,lung,kidney,liver,reproductiveandendocrineorgans,immuneorgans,muscle,andskinarefromageneralizedmousegeneexpressiondatabase.;ProbepreparationandmicroarrayhybridizationwereperformedbyIncyteGenomics(PaloAlto,CA)usingtheGEMBrightrandomprimerreversetranscriptionlabelingkit(IncyteGenomics).

LabeledcDNAwaspreparedfromeachpoly(A)+RNAsampleusingnucle-

otideslabeledwiththe?uorescentdyeCy5.

LabeledcDNAswerethensubjectedtocompetitivehybridizationtomouseGEM1microarrays,composedofspottedcDNAscorrespondingto8,638sequence-veri?edIMAGEexpressedsequencetag(EST)clones(500–5,000nucleotidesinlength)withalowredundancyratewithrespecttotheircorrespondinggeneproducts.

Forallsamplesinthedatabase,hybridizationswereperformedincompetitionwithCy3-labeledmRNAfromwholepostnatalday1(P1)mouse.;;数据的预处理:

数据分析、点几何学和背景荧光用IncyteGEMTools软件处理。

1、芯片上有缺陷的点(不规则的几何形状、有刮痕、点的面积小于平均面积的40%)在数据集中被删除;

2、数据的对数转化:所有数据集用Cy5测量通道中值除去Cy3测量通道中值进行平衡系数归一化;

3、每张芯片包含192个对照基因,包括非哺乳动物单个基因和大多数细胞类型中表达的基因构成的复杂靶标。

4、每个实验中mRNA样品用增加数量的非哺乳动物RNA(2-fold、4-fold、16-fold,etc)进行放大从而允许对从每张芯片中获得的动态范围进行评估。;第二阶段的数据分析用Gene-spring软???处理。

1、基因的归一化处理:

①Cy5对数值/Cy3对数值

②用LOWESS方法进行局部加权归一化处理

③一系列探针中每个基因的归一化

每个测量值/全部测量值中值=0.01

每个

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