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CN113583876A
CN113583876A
(12)发明专利申请
(10)申请公布号CN113583876A
(43)申请公布日2021.11.02
(21)申请号(22)申请日
(71)申请人
202110882861.7
2021.08.02
中国农业科学院上海兽医研究所
(中国动物卫生与流行病学中心上
海分中心)
地址200241上海市闵行区紫月路518号
(72)发明人谷峰程培培
(51)Int.Cl.
C12N1/11(2006.01)
C12N15/30(2006.01)
C12N15/90(2006.01)
C12R1/90(2006.01)
权利要求书1页说明书5页
序列表6页附图1页
(54)发明名称
EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔
球虫虫株的制备
(57)摘要
本发明公开EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备。该专利将FnCas12a蛋白,体外合成的crRNA和同源重组片段(含有P2A-DHFR-EYFP表达框的Et.Actin基因)利用Lonza4D-Nucleofector核转仪导入鸡柔嫩艾美尔球虫子孢子,实现对鸡柔嫩艾美尔球虫的编辑。将编辑虫株经过鸡体内乙胺嘧啶筛选,获得高纯度的基因编辑虫株。然后,利用PCR和Sanger测序技术对基因编辑虫株进行验证,证明EYFP成功标记了Et.Actin基因。通过细胞培养该虫株的子孢子并感染鸡后,取盲肠粘膜并涂片显示该EYFP在基因编辑虫株的整个生活史中都有表达。此基因编辑方法能够对鸡球虫的基因进行定点标记,有助于解析球虫基因的功能。本专利对新
型抗球虫药物和疫苗的研发也具有重要意义。
1/1页CN113583876A权利要
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CN113583876A
2
1.一种EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备方法,其特征在于该制备方法是利用FnCas12a/crRNA对鸡柔嫩艾美尔球虫基因组进行编辑,主要包括如下步骤:1)FnCas12a蛋白的表达与纯化;2)Et.Actin基因编辑位点crRNA的体外合成;3)Et.Actin基因特异性编辑位点同源重组模板的构建;4)EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫
株的构建;5)EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的验证。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤1)中FnCas12a的表达载体序列如SEQID
NO.1所示。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤2)中Et.Actin基因的crRNA序列如SEQ
IDNO.2所示。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤3)中Et.Actin基因特异性编辑位点的同
源重组模板序列如SEQIDNO.3所示。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤4)中EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的构建步骤为:将30μgFnCas12a:crRNA(摩尔比1:1)和40μg线性化的pActin-P2A-DHFR-EYFP同源重组模板利用Lonza4D-Nucleofector的100uL核转杯和转染程序EH100转入1×10的球虫子孢子;将转染子孢子通过泄殖腔接种给3日龄的雏鸡,经过
乙胺嘧啶的3次筛选,获得高纯度的基因编辑虫株。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤5)EYFP敲入Et.Actin基因的柔嫩艾美尔球虫虫株的验证是利用PCR和Sanger测序技术对基因编辑虫株进行验证;所用的引物序列如SEQIDNO.4;NO.5;NO.6;NO.7;NO.8;NO.9所示,并观察EYFP在基因编辑虫株整个生活
史中的表达情况。
7.如权利要求5所述的方法,其特征在于乙胺嘧啶在3次传代中的筛选浓度分别为150
mg/kg;250mg/kg;300mg/kg。
1/5页CN113583876A说明
1/5页
CN113583876A
3
EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备
技术领域
[0001]本发明涉及分子编辑领域,具体涉及EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备,尤其涉及EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备方法及其应用,该方法利用FnCas12a介导的基因编辑技术对鸡柔嫩艾美球虫的Et.Act
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