EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备 (1).docVIP

CN113583876A

CN113583876A

(12)发明专利申请

(10)申请公布号CN113583876A

(43)申请公布日2021.11.02

(21)申请号(22)申请日

(71)申请人

202110882861.7

2021.08.02

中国农业科学院上海兽医研究所

(中国动物卫生与流行病学中心上

海分中心)

地址200241上海市闵行区紫月路518号

(72)发明人谷峰程培培

(51)Int.Cl.

C12N1/11(2006.01)

C12N15/30(2006.01)

C12N15/90(2006.01)

C12R1/90(2006.01)

权利要求书1页说明书5页

序列表6页附图1页

(54)发明名称

EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔

球虫虫株的制备

(57)摘要

本发明公开EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备。该专利将FnCas12a蛋白，体外合成的crRNA和同源重组片段(含有P2A-DHFR-EYFP表达框的Et.Actin基因)利用Lonza4D-Nucleofector核转仪导入鸡柔嫩艾美尔球虫子孢子，实现对鸡柔嫩艾美尔球虫的编辑。将编辑虫株经过鸡体内乙胺嘧啶筛选，获得高纯度的基因编辑虫株。然后，利用PCR和Sanger测序技术对基因编辑虫株进行验证，证明EYFP成功标记了Et.Actin基因。通过细胞培养该虫株的子孢子并感染鸡后，取盲肠粘膜并涂片显示该EYFP在基因编辑虫株的整个生活史中都有表达。此基因编辑方法能够对鸡球虫的基因进行定点标记，有助于解析球虫基因的功能。本专利对新

型抗球虫药物和疫苗的研发也具有重要意义。

1/1页CN113583876A权利要

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1.一种EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备方法，其特征在于该制备方法是利用FnCas12a/crRNA对鸡柔嫩艾美尔球虫基因组进行编辑，主要包括如下步骤：1)FnCas12a蛋白的表达与纯化；2)Et.Actin基因编辑位点crRNA的体外合成；3)Et.Actin基因特异性编辑位点同源重组模板的构建；4)EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫

株的构建；5)EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的验证。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中FnCas12a的表达载体序列如SEQID

NO.1所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)中Et.Actin基因的crRNA序列如SEQ

IDNO.2所示。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中Et.Actin基因特异性编辑位点的同

源重组模板序列如SEQIDNO.3所示。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4)中EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的构建步骤为：将30μgFnCas12a:crRNA(摩尔比1:1)和40μg线性化的pActin-P2A-DHFR-EYFP同源重组模板利用Lonza4D-Nucleofector的100uL核转杯和转染程序EH100转入1×10的球虫子孢子；将转染子孢子通过泄殖腔接种给3日龄的雏鸡，经过

乙胺嘧啶的3次筛选，获得高纯度的基因编辑虫株。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤5)EYFP敲入Et.Actin基因的柔嫩艾美尔球虫虫株的验证是利用PCR和Sanger测序技术对基因编辑虫株进行验证；所用的引物序列如SEQIDNO.4;NO.5;NO.6;NO.7;NO.8;NO.9所示，并观察EYFP在基因编辑虫株整个生活

史中的表达情况。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于乙胺嘧啶在3次传代中的筛选浓度分别为150

mg/kg;250mg/kg;300mg/kg。

1/5页CN113583876A说明

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EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备

技术领域

[0001]本发明涉及分子编辑领域，具体涉及EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备，尤其涉及EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备方法及其应用，该方法利用FnCas12a介导的基因编辑技术对鸡柔嫩艾美球虫的Et.Act