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团集亚隔孢壳检疫鉴定方法

1范围

本文件适用于田间生长和盆栽的苏铁上的团集亚隔孢壳的检疫鉴定。

本文件规定了团集亚隔孢壳的的分离培养、形态学鉴定、分子生物学鉴定方法。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4团集亚隔孢壳基本信息

病害中文名：苏铁叶枯病菌

病害英文名：LeafnecrosisorblightofCycasrevoluta

病原学名及中文名：Didymellaglomerata(Corda)QianChenL.Cai，团集亚隔孢壳

异名：ConiothyriumglomeratumCorda,Icon.Fungorum(Prague)4:39.1840.

Aposphaeriaglomerata(Corda)Sacc.,Syll.Fung.(Abellini)3:175.1884.

Phomaglomerata(Corda)Wollenw.Hochapfel,Z.Parasitenk.3(5):592.1936.

Peyronellaeaglomerata(Corda)Goid.exTogliani,Ann.Sperim.Agrar.III6:93.

1952.

分类地位：真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，座囊菌纲Dothideomycetes，格孢腔菌

目Pleosporales，亚隔孢壳科Didymellaceae。

团集亚隔孢壳的其他信息见附录A。

5方法原理

根据病害症状、分离菌的形态特征（附录A）以及实时荧光PCR检测对团集亚隔孢壳

进行检测鉴定。

6试剂、材料和培养基

6.1试剂和材料

除有特殊说明外，所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂。

试剂包括：次氯酸钠溶液（活性氯＞10%），琼脂粉，葡萄糖，琼脂糖，无菌双蒸水，CTAB

提取缓冲液（2%CTAB,1.4MNaCl,20mMEDTA,100mMTris•HClpH8.0），Tris饱和酚，三

氯甲烷，异戊醇，异丙醇，无水乙醇，RNaseA，液氮，苯酚，氯仿，蛋白酶K，TaqDNA聚合

酶，dNTP，TaqManMasterMix，核酸染料，DNA分子质量标准物等。

材料包括：DNA提取试剂盒，PCR反应试剂盒、电泳缓冲液。

6.2培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），燕麦片琼胶培养基（OA），具体配方见附录B。

7仪器和用具

7.1仪器

体视镜、显微镜（放大倍数400倍以上）、培养箱、高压灭菌器、超净工作台、组织破碎仪、

恒温水浴锅、离心机、电子天平、超纯水仪、漩涡振荡器、冰箱、微量移液器（0.5µL，2.5µL，

10µL，20µL，200µL，1000µL）、PCR仪、实时荧光PCR仪、核酸电泳仪、凝胶成像系统。

7.2用具

培养皿、酒精灯、量筒、烧杯、镊子、载玻片、盖玻片、玻璃珠、吸头、离心管（1.5mL）、

PCR管（0.2mL）等。

8检疫鉴定方法

8.1症状检查与病害症状

苏铁叶片感染初期，通常表现为中下部叶片上出现典型叶斑，叶斑较小、圆形、棕色，

边缘黄色，几乎覆盖了30%的叶片面积，同时边缘坏死。这些病斑大小约为1-3毫米，随着

发病进程的进行，病斑通常增大且合并，形成更大的坏死区域。在严重的情况下，受感染的

叶片最终会枯萎并呈现灼烧的外观。坏死组织被病原真菌生长定植。枯萎的叶片上会出现浅

棕色至深棕色或黑色的小斑点，即分生孢子器，用手持放大镜即可观察到。受感染的植物开

始枯萎并最终死亡。病害症状见图A.1。

8.2病原菌分离培养

22

采用PDA用于病原菌的分离和菌种保存。将坏死和健康交界处发病组织剪成1mm～2mm

的小块，浸没在0.5％次氯酸钠溶液中消毒90s后，无菌水冲洗3次，灭菌滤纸吸干水分后放置在

PDA培养基上，将