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实验五 应用孔洞法测定抗菌剂的抑菌效果
一、目的要求:观察抗菌剂抗菌的作用效果,熟练掌握琼脂孔洞法体外测定抗菌物质的抗菌活性。
二、原理:抗菌物质从孔洞中向琼脂培养基扩散渗透,通过对试验菌的抑杀作用而影响细菌生长繁殖,使菌落形成抑菌圈,依抑菌圈的大小确定抑菌物质抗菌能力的强弱。
三、材料
菌种:大肠杆菌菌,用营养肉汤培养16~18h得到的菌液。
药品:氨苄青霉素,肉汤培养基。
器材:生化培养箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、灭菌肉汤琼脂培养基、酒精灯、平皿、吸管、打孔器(内径6-8mm)、镊子、记号笔、尺子(游标卡尺)等。
四、实验步骤
按照实验一(培养基的配制)的方法步骤配制好肉汤培养基,并在121℃,灭菌20min后,放在60℃水浴锅中保温,注意温度恒定,不要让培养基凝固。
将已经培养好的菌制成一定浓度(106cfu/mL)的悬浮液,用移液管移取1mL该菌悬液至灭过菌的(121℃,20min)培养皿中,倒入15mL已灭菌的培养基(温度约45℃,用手摸瓶壁不感觉烫手即可),轻轻转动培养皿,使培养基与菌液混匀,静置凝成平板。
将用于试验的防腐剂(抑菌物质)配制成3个所需的浓度(见表1),用打孔器在平板上按顺时针均匀打4个孔,用无菌的镊子将孔内的培养基取出,按顺时针的顺序依次缓慢地滴加0.2mL对照液、不同浓度的抑菌剂到孔洞内。
按上述方法,每个浓度做3个重复。
在37℃下培养24h,用直尺或游标卡尺测量抑菌圈的大小。五、注意事项
应在无菌条件下操作,试验完毕后及时灭菌处理。
注意滴加无菌水和氨苄青霉素的体积要准确,避免误滴到孔洞以外的地方。
六、实验结果
表1琼脂孔洞法测定抗菌剂的抑菌效果
菌株 药物 浓度(μg/mL) 抑菌圈直径(mm) 抑菌圈平均数
50
50
50
100
大肠
氨苄青霉素
杆菌
100
100
300
300
300
思考题:如何判定防腐剂或抑菌物质的抑菌效果,说明其食品应用的指导意义。
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