聚丙烯酰胺凝胶电泳(共42张PPT).pptxVIP

聚丙烯酰胺凝胶电泳;1、作用

分离蛋白质、核酸

2、概念

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好、有弹性、透明、化学性质稳定、对pH和温度变化小、没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。

;聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下合成。

聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电荷效应、分子筛效应。;（1）丙烯酰胺结构式

;（2）亚甲双丙烯酰胺;PAGE的聚合;

注意：

?TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合

?分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧

?升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合

;（2）光聚合：核黄素-TEMED系统;;SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳;概述;基本原理;;实验原理;浓缩效应：不连续性所致

制胶缓冲液：Tris-HCl

（根据亚基分子量分离蛋白质）

(3)二硫键是否完全被还原

与蛋白质的结合量：大多数1.

(2)样品缓冲液的离子强度

混匀后，置真空干燥器中，抽气10min

圆盘电泳

不连续SDS

1967年由Shapiro建立。

注入电极缓冲液用

(3)二硫键是否完全被还原

选择适当的凝胶浓度。

（根据亚基分子量分离蛋白质）

＞100糊状不成形，易破碎。;SDS和还原剂的作用：

（1）分子被解聚成组成它们的多肽链

（2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束；蛋白质-SDS胶束所带的负电荷达到超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。;蛋白质-SDS胶束的特点：

（1）形状像一个长椭圆棒

（2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的

（3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。

胶束在SDS系统中的电泳迁移率主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。;围选择适宜的分离胶

蛋白质-SDS胶束的特点：

1967年由Shapiro建立。

制胶缓冲液：Tris-HCl

PAGE孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。

(1)溶液中SDS单体的浓度

大小形状不同所致）

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

当T固定时，Bis浓度在5%时??径最小。

糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。

1969年由Weber和Osborn进一步完善。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native）

蛋白质-SDS胶束所带的负电荷达到超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。

PAGE的浓度与孔径的关系

SDS和还原剂的作用：;PAGE的浓度与孔径的关系;;3、分类;电泳体系中所用的缓冲液成分、pH、凝胶浓度相同;不连续SDS

1.原理;①凝胶的不连续性：

浓缩胶：大孔径。样品在其中浓缩，并按迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。

分离胶：小孔径。蛋白质分子在大孔胶中受到的阻力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到的阻力大，迁移速度减慢。由于凝胶的不连续性，在大孔胶和小孔胶界面处就会使样品浓缩，取带变窄。;②缓冲离子的不连续性

③pH的不连续性

④电位梯度的不连续性

制胶缓冲液：Tris-HCl

浓缩胶pH6.7分离胶

电泳缓冲液：Tris-甘氨酸

在浓缩胶中，pH环境呈弱酸性，甘氨酸解离少，在电场作用下泳动效率低，而Cl—却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子介于二者之间泳动。;由于导电性与电场强度成反比，这一区带形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。

样品进入分离胶（）后，由于胶中pH的增加，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随Cl-之后，样品不再受离子界面的影响。;实验过程;实验步骤;试剂名称;2.分离胶的制备

胶灌至距梳子齿下端1cm→灌毕→封上一层水加速

聚合→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。

3.浓缩胶的制备

用滤纸吸干水→倒入

浓缩胶→插入梳子→静置，聚合。

;二、样品处理与加样

1.样品处理

2.加样

小心拔出梳子上下槽

注入电极缓冲液用

微量进样器点样

三、电泳

接上电泳仪，上槽为负极，下槽为正极。打开

开关，保持恒压进行电泳。;电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。;流程图;结果分析;2.标准曲线的绘制;3.未知蛋白质样品分子量的测算

;在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线