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2.5细胞裂解

细胞从培养皿上被刮下来之后，在15ml灭菌塑料试管中用PBS洗涤3次，每次

洗涤用10mlPBs充分重悬细胞，在4“c下5009离心5min。所有操作在冰上进行。

最后一步洗涤把细胞转移到1.smlePpendorf管中。把细胞充分重悬在TAP细胞裂

解液中。根据细胞量决定裂解缓冲液的体积(一般每10川细胞用100川一200川

TAPBu价r)。放置于冰上30min，每10min用移液枪吹打细胞一次使之充分悬浮。

在4OC下用100009高速离心15min，把上清转移到新的试管中进行下一步实验，

丢弃沉淀。

2.13细胞自噬活性的检测

我们主要通过两条途径来诱导细胞发生自噬，一饥饿处理，二药物RaPamycin处理。对

于饥饿处理，吸去正常培养的细胞中的培养液，用PBS小心洗涤细胞三次，注意不要使细

胞脱离培养皿，加入15mlEBss(用量根据培养皿的大小而定)连同2林M的ED64和pePstatin。

在37“C培养箱中培养2一4h。对于RaPamycin处理，在普通细胞培养液中加入终浓度为

500nM的R叩amyein(sigma)37“e下培养12h。细胞自噬活性的检测主要有两条途径，一

条是通过转染GFP一LC3，再用荧光显微镜观察LC3在细胞质中的聚集。二是用

westemblotting和LC3的抗体，检测细胞内源LC3n的增加。对于荧光显微镜分析，

在U20S细胞中转染GFP一LC3，24h之后，把细胞继代培养在有

盖玻片的6孔板中，诱导自噬，吸去培养液，用PBS小心润洗玻片1

次，在每个孔内加入3%的多聚甲醛，在室温下闭光摇晃培养玻片

20min。用PBS洗涤玻片3次，每次每孔加2mlPBS在室温下摇晃

10min，用固定液把盖玻片固定在载玻片上，在室温下干燥1min之

后用荧光显微镜观察。

对于westemblotting，从培养皿上收集药物或饥饿处理之后的

细胞，加入1‘SDS蛋白上样缓冲液，并用超声波处理直到不粘稠为止，95“e煮沸样品5min，

室温下高速(100009)离心5min，通过SDs一pAGE并用LC3的抗体(sigma)进行westemblotting

检测，自噬活性越高的细胞内LC3n的条带浓度越高。

1.2.1自噬体检测

实验分为3组,分别为自噬诱导组,自噬抑制组和雷帕霉素组。自噬诱导组:1×105

RAW264.7细胞培养至对数生长期,加入50nmol/L雷帕霉素作用3h,然后按感染复数（MOI）

=1∶10比例加入1×109CFU/L的H37Rv菌株培养3h,PBS（pH7.4）缓冲液洗脱3次以洗脱未

结合的H37Rv菌株。自噬抑制组:RAW264.7细胞加入自噬抑制剂3MA（600mg/L）作用36h,

然后按MOI=1∶10比例接种H37Rv菌株作用3h。雷帕霉素组:RAW264.7细胞培养至对数生

长期,加入50nmol/L雷帕霉素作用3h。上述各组细胞胰酶消化后收集,20g/L锇酸固定过夜,

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透射电镜观察自噬体的形成。

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1.2.2菌落形成单位（CFU）检测

自噬诱导组和自噬抑制组细胞胰酶消化后收集,加入2倍体积双蒸水裂解细胞,7000

r/min离心,收集沉淀,重悬后1∶107稀释,取100μL悬液接种于7H10培养基,37℃培养21d

进行菌落计数。

2结果

2.1自噬体检测

雷帕霉素作用于RAW264.7细胞后,以H37Rv菌株感染细胞,透射电镜可发现细胞