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JJF1665—2017

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流式细胞仪校准规范

1范围

本规范适用于基于荧光检测原理的分析型流式细胞仪的校准。其他类型的流式细胞仪(以下简称仪器),可参照本规范执行。

2引用文件

本规范引用了下列文件:

JJF1071—2010国家计量校准规范编写规则

JJF1265生物计量术语及定义

凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本规范;凡是不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本规范。

3术语

JJF1265定义的及以下术语和定义适用于本规范。

3.1等量可溶性荧光分子moleculesofequivalentsolublefluorochrome,MESF

颗粒发出的荧光信号强度相当的可溶性荧光素分子的物质的量浓度。用于表示颗粒发出的荧光信号强度。

4概述

流式细胞仪由液流系统、光学系统、检测系统和分析系统四部分组成(见图1)。测量原理为鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束,与水平方向的激光束垂直相交,染色的细胞受激光照射后发出荧光或产生散射光,这些信号分别被光电倍增管荧光检测器和光电二极管散射光检测器接收,经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息,就可得到细胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性质等物理和生化指标。

5计量特性

5.1分辨力

5.2线性相关系数

5.3检出限

5.4漂移

5.5重复性

5.6示值误差

JJF1665—2017

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图1流式细胞仪组成示意图

6校准条件

6.1环境条件

实验室环境应当满足仪器厂家的安装要求:

环境温度(15~30)℃;

相对湿度≤70%。

6.2标准物质和校准设备

6.2.1标准物质

单一荧光强度的荧光微球标准物质;

多重荧光强度混合荧光微球标准物质;

计数荧光微球标准物质;

淋巴细胞计数标准物质。

6.2.有证标准物质,相对扩展不确定度不超过20%(k=2)。

去离子水(18.2MΩ·cm,0.22μm滤膜过滤);

0.1mol/L磷酸钠缓冲液pH(7.2~7.4)。

6.2.3校准设备

移液器,量程(200~1000)μL,B级及以上。校准设备需经检定合格。

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7校准项目和校准方法

7.1分辨力

仪器经预热,进入正常工作状态。在装有0.5mL经过0.22μm滤膜过滤的磷酸盐缓冲液的试管中,移取0.5mL单一荧光强度的荧光微球标准物质,充分混匀后上机实验。记录前向角散射光和488nm激发下两个荧光通道,包括绿色荧光(FITC异硫氰酸荧光素)、橙红色荧光(PE藻红蛋白)。收集门内有效信号10000个,按式(1)计算前向角散射光和两个荧光通道中校准微球峰宽的相对标准偏差(RSD),以表示分

辨力。

RSD=×100%(1)

式中:

RSD———相对标准偏差,%;

δ———颗粒分布的标准差;

μ———颗粒分布的平均值。

7.2线性相关系数

在装有1mL经过0.22μm滤膜过滤的磷酸盐缓冲液的试管中加入20μL多重荧光强度混合荧光微球标准物质,充分混匀后上机实验,记录488nm激发下绿色荧光(FITC)、橙红色荧光(PE)通道信号。对试验结果进行直方图分析,荧光强度从低到高至少5种不同的荧光强度峰(峰的数量和强度取决于所采用的多重荧光强度水平标准微球标准物质),每个峰收集10000个门内有效信号,得到每个峰的平均荧光强度。根

据校准微球标准物质证书提供的各个峰的等量可溶性荧光分子(MESF),将各峰的

MESF取对数lg(MESF),简化表示为y,各峰测量的平均荧光强度取对数lg(FITC)

或lg(PE),简化表示为x,将两者线性回归得到方程y=kx+b,按式(2)分别计算

两个通道的线性相关系数(r)。

r=

式中:

(xi-x)(yi-y)

i=1

(-

(-)

(x