基因检测的国际金标准是什么 .pdfVIP

基因检测的国际金标准是什么

sanger测序是基因检测国际金标准。

sanger测序概念

分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于DNA测序的技

术主要有FrederickSanger发明的Sanger双脱氧链终止法（ChainTerminationMethod）。Sanger法是根据核

苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、

T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可

见的DNA碱基序列。

sanger测序原理

利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次

序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一

种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择

性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可

以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核

苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同

位素标记进行检测。DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3-OH末端的单链寡核苷酸引

物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3-OH

末端，使引物延伸，合成出新的互补DNA链。如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），

因它在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。如，存在ddCTP、dCTP

和三种其他的dNTP（其中一种为α-32P标记）的情况下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形

成一种全部具有相同的5-引物端和以ddC残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。经变性聚丙

烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信

息，从而将全部C的位置确定下来。类似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条件下，可同时制得

分别以ddA、ddG和ddT残基为3‘端结尾的三组长短不一的片段。将制得的四组混合物平行地点加在变性

聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，制得相应的放射

性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。

sanger测序为什么是目前基因检测国际金标准

sanger测序是目前所有基因检测的国际金标准，是包括荧光定量PCRTaqman探针法、普通PCR法、

芯片法、二代测序法、质谱法等方法的金标准。科研领域发表基因检测相关文章，必须要有sanger测序验

证数据予以支持。

sanger测序之所以是目前基因检测的国际金标准，是因为sanger测序原理非常科学，过程非常缜密，

结果真实可视，准确率非常高，达到99.999%。不需要建库，属于直接测序，直接读取结果，连续读取数

据（不是一个点），不需要推导结论，过程明朗数据支撑充分。这项技术是虽然经过了38年，但应用仍然

广泛，还是测序的主力军，好多检测其他方法不能替代，她金标准的地位几十年内很难替代。

精准：流程细致，质控环节多，污染低，结果直观可视，假性结果极低

1、由于没有建库环节，所以微量样品不会任意扩大，从而产生假阳性结果（与二代测序比）；

2、sanger测序首先要做PCR有限扩增，然后切胶回收主带，此过程不容易污染，即使有少量污染扩增

出的杂带，切胶回收可以有效分离，切胶回收后，电泳前要用特异性单引物测序PCR反应一次，等于又筛

选了一次，所以sanger测序这种方法非常精准，非常不容易污染。

3、sanger测序是建立在目的基因精确物理定位基础上的测序（得到的结果是连续的、可视的、真实的

长片段，所以出来的数据不会张冠李戴，即使读错了结果，也可以从读取的峰图序列中判出（与荧光定量PCR

Taqman探针法、普通PCR法、质谱法、芯片法、二代测序法等方法比）；

4、基因突变可分为碱基置换、颠换、