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关于动物细胞融合第1页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三动物细胞融合细胞融合是正常的生命活动受精作用两个细胞正在融合第2页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三动物细胞融合基本过程：第3页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三诱导方法：诱导方式物理法：化学法：生物法：灭活的病毒电刺激聚乙二醇PEG第4页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三聚乙二醇PEG具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质的作用，能够有效地促进植物原生质体和动物细胞的融合。在不同种类的动物细胞混合液中加入聚乙二醇，就会发生细胞凝集作用；在稀释和除去聚乙二醇的过程中，就会发生细胞融合。聚乙二醇诱导细胞融合的机理，目前还不太清楚。聚乙二醇是化学试剂，使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比较高，但是它有一定毒性，对有些细胞(如卵细胞)不适用。聚乙二醇PEG诱导融合第5页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三实验原理：利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜，在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。第6页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三利用PEG介导细胞融合,其融合效果受以下几种因素的影响：PEG的分子量与浓度:细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高,对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。第7页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三2.PEG的pH值:经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。3.PEG的处理时间:处理时间越长，融合效果越好,但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养,故处理时间可适当放宽至数分钟。第8页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三4.融合时的温度:由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果,在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细胞,一般采用的温度为38~40℃。而本次试验基本在37℃的条件下进行。第9页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三实验选材：本次试验选用鸡的外周血做细胞融合材料,这是因为:1.鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；2.实验材料便宜、易得，避免了用培养的细胞株做细胞融合实验材料所耗的实验成本和精力；3.细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。若细胞内只有一个核，定为未融合细胞；有二至多个核，定为融合细胞。第10页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三实验步骤：取新鲜鸡血,制成体积分数10%鸡红细胞悬液。称0.5gPEG(MW=4000)，熔化。尽快加入0.5ml预热80℃的Hanks液，制成质量分数50%PEG，轻轻摇匀，散温，置37℃恒温水浴箱中备用（以防冷却后会形成结晶）。吸取1mL悬液置刻度离心管中,另加5mLHanks液,混匀,离心（1000r/min）5min。第11页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三吸取0.5mlPEG加入鸡红细胞沉淀管内，1min内加入离心管中，边滴边摇晃（此过程必须在37℃水浴箱中进行）。静置1min后，加入9mlHanks液，轻轻吹打混匀，在37℃水浴箱中放置10min。吸弃上清液，使沉淀物松散，置37℃水浴箱中维持。第12页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三离心（1000r/min）5min,吸弃上清液，加入1ml不含血清的1640培养液，混匀后取1滴悬液制成临时装片。用质量分数为0.12%的次甲基蓝染色。镜检。离心（1000r/min）5min,吸弃上清液，加入3ml含小牛血清的1640培养液，轻轻吹打混匀，置37℃水浴箱中温育30min。第13页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三注意事项：1、注意PEG浓度和作用时间等，即在制备鸡红细胞沉淀物时，一定不要有残留的液体存在，并且要在37℃水浴锅中于15min内全部滴完PEG，这样融合的效果最好；2、制备50%