基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法.pptVIP

总而言之，标本的保存及适当的预处理对核酸模板的成功提取具有决定性作用。要强调的是，所有用于上述处理的容器如试管或离心管，均应在使用前压灭菌。第30页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三核酸的提取第31页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为：裂解细胞去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。第32页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三沉淀核酸纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质第33页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三(一)DNA提取的经典方法DNA提取的经典方法，即所谓的酚-氯仿提取法。因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去，提取次序为酚、酚/氯仿（1：1）、氯仿，这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好，缺点是较为繁琐。第34页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三经前处理的标本加入蛋白酶K,摇匀56oC温育1小时,或37oC消化6小时以上/过夜加入等体积饱和酚,充分混匀

第35页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三12000rpm,离心5分钟

将上层水相移至一干净离心管内，加等体积酚/氯仿(1:1)混合液，混匀第36页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三12000rpm，离心5分钟取水相，移至一干净离心管内，加等体积氯仿，混匀后12000rpm，离心5分钟取水相，移至一干净离心管内，加2倍体积预冷的无水乙醇，沉淀DNA摇匀，可见白色絮状DNA，置-20oC，30分钟或过夜第37页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三12000rpm，离心5分钟弃上清，用预冷70%乙醇洗两次，室温干燥5分钟加适量TE缓冲液或无菌去离子H2O溶解DNA，混匀紫外分光光度仪测OD值，4oC备用第38页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三说明：回收上层水相时，一定不要接触两相的界面，以免将蛋白质等物质吸入新离心管。沉淀DNA，无水乙醇是首选的有机溶剂。另：异丙醇、醋酸钠等。第39页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三70%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在70%的乙醇中保持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。TE缓冲液：10mmol/LTris-Hcl1mmol/LEDTApH8.5或8第40页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三RNA的提取RNA提取条件较DNA要求严格，主要是因为临床标本及实验室环境中，存在大量对RNA有强烈降解作用RNase。RNase是一类生物活性非常稳定的酶类。这种酶耐酸、耐碱、耐高温，如煮沸也不能使之完全失活。第41页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三蛋白质变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。除细胞内RNase以外，环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液及唾液中均存在RNase，因此在提取RNA时，关键要避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解。第42页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三第1页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三应用聚合酶链反应（PCR）技术测定临床标本中的病原体核酸成分，是一种高度敏感，且最为直接的检测手段。由于临床标本中含有蛋白质、脂类等物质，可干扰PCR反应，故在做PCR反应前必须进行核酸提取。第2页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三经典的核酸提取方法通常是加去污剂（SDS等）裂解细胞，经蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。第3页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三由于样本的处理及保存对DNA和RNA（尤其是RNA）的影响较大，因此在核酸测定时标本的处理及适当保存对测定结果的准确有效非常重要。第4页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三临床常见的标本有血清（浆）、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、新鲜组织、石蜡切片等，这些临床标本的处理和保存方法各有不同。第5页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三临床标本的处理第6页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三血清（浆）标本一些病原体，如乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）等的PCR检测常采用血清或血浆标本。第7页，讲稿共60页，2023年5月2日，星期三HBV：标本通常由