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DNA细胞周期检测

基础原理概述KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity 正常人静止体细胞有46条染色体,相当于7.10-12pgDNA/细胞核,我们称之为二倍体细胞,而正常增殖细胞则存在不一样DNA含量。在细胞周期(G0,G1,S,G2,M)各个时期,DNA含量随各时相展现出周期性改变:在G1期,细胞开始RNA和蛋白质合成,但DNA含量仍保持二倍体;

进入S期后,DNA开始合成,这时细胞核内DNA含量介于G1和G2期之间;当DNA复制结束成为4倍体时,细胞进入G2期,G2期细胞继续合成RNA及蛋白质,直到进入M期,所以,单纯从DNA含量无法区分G2期和M期;一旦有丝分裂发生,细胞分裂成两个子细胞,这两个子细胞或者进入下一个细胞周期,或者进入静止期(G0期),而G0期从DNA含量上一样无法与G1期区分。所以,整个复制周期能够描述为G0/G1,S,G2/M期。KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity

经过核酸染料标识DNA,并由流式细胞仪进行分析,能够得到细胞各个时期分布状态,计算出G0/G1%,S%及G2/M/%,了解细胞增殖能力,在肿瘤病理学研究中,通常以S期细胞比率作为判定肿瘤增殖状态指标。正常细胞含有较恒定DNA含量,而细胞癌变过程中结构和/或染色体异常是很常见。这种改变在流式分析中以DNA倍体指数形式表现出来,这一指数对于肿瘤早期诊疗,交界瘤、间叶组织肿瘤良恶性判定提供了关键辅助指标。KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity

KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity流式DNA周期示意图G0/G1静止期及合成前期S合成期G2/M合成后期及分裂期

样本制备KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity 起源于血液、骨髓、体液、灌洗液、外科手术活检、细针穿刺物等细胞都可用来做DNA分析。新鲜、冰冻或固定保留、或常规固定/包埋用于组织检验样本均可。通常最好结果来自新鲜或冰冻标本。用组织切片好处是能够经过观察常规染色来选择感爱好区域,缺点是不能再用抗体染色来判别肿瘤细胞和正常基质细胞。

实体标本单细胞制备KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity 机械法:用剪刀、刀片剪切组织或金属网研磨获取完整细胞。但该法获取细胞数量少。 化学药品处理法:利用EDTA或Sodiumcitrate结合Ca2+或Mg2+等阳离子,破坏细胞间连接或用TritonX-100、NP-40破坏细胞膜。该法只能取得细胞核,且易出现核凝集。 酶法:利用酶将细胞间连接物水解,使细胞从组织中分离出。通常常见为胃蛋白酶及胰蛋白酶。该法也只能取得细胞核。

细胞浓度及质量要求KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity 单细胞和核最终浓度应约106/ml。浓度太低,上机时样本流速不得不提升,这么就会影响检测CV。浓度太高,则可能造成染料相对不足,最终使染色不饱和,一样影响CV和检测结果。 制备完成后标本应用光学显微镜检验其质量:细胞是否聚集或过多碎片;大多数核有肿瘤样外观(比如说,不是粒细胞)等。确保足够肿瘤细胞含量;检测S%时提议最小可接收百分比是20%。

固定KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity 常见70%冰酒精固定单细胞悬液。应确保样本完全浸没在固定剂中置40C冰箱固定4小时上。对于甲醛固定组织切片,应注意甲醛会影响PI与核酸结合。若同时使用抗体判别肿瘤细胞,应选择对抗原无损固定剂。对很多细胞表面抗原来说,固定只能在抗体标识以后进行。

染色KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity 染料选择取决于流式激光配置。488nm激光下应用PI(碘化丙啶),因为PI也与双链RNA结合,所以分析前样本应用Rnase处理。关键是染料要足够,以确保饱和结合。PI推荐浓度是最少20ug/106个细胞。其最好浓度为50ug/106个细胞。在室温200C下避光孵育30分钟,3小时内上机分析。

影响荧光染色原因KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity温度:温度高于200C时,即出现温度淬灭。 PH:PI在7.2~