激酶抑制剂测试第四章节-激酶抑制剂检测方法详细介绍（二）.pdf

激激酶酶抑抑制制剂剂测测试试第第四四章章节节-激激酶酶抑抑制制剂剂检检测测⽅⽅法法详详细细介介绍绍 （（⼆⼆）） 1 均均相相⾮⾮放放射射性性同同位位素素法法 上 这些⾮均相的⽅法，存在操作繁多的问题。随着技术的发展，越来越多的均相⾮放射性⽅法开始被应⽤于激酶活性的检测 之中，根据实验原理的不同，可以分为检测ATP的量、检测A DP的量、检测带标记或修饰的多肽底物、配体激酶结合法等。 1.1 检检测测剩剩余余的的ATP的的量量 有些⽅法可以利⽤测定激酶反应中未被消耗掉的ATP量来检测酶活，例如Promega公司的Kinase-Glo™技术。该⽅法利⽤激 酶反应后剩余的ATP，将荧光素转化为氧化荧光素，并发出化学冷光，荧光信号值与激酶活性成反⽐。该试剂盒⾥的重组热稳 定荧光素酶(Ultra-GloTM)，发出稳定的“辉光”型荧光，半衰期⼤于5个⼩时，不需要配套进样器的荧光仪，可成批处理⼤量的 微孔板。Ultra-GloTM发出的稳定荧光可适⽤于多种检测条件，与特定的缓冲液组成相搭配，可减少来⾃化合物的⾃发荧光的 ⼲扰。 该检测⽅法的成本很低，但为了产⽣⼤于2倍的信噪⽐，⾄少需要50%的转化率，因此不能⽤于进⾏激酶性质的研究，但 在ATP产⽣50%~80%转化率的时候，抑制剂的活性的偏移在2到 倍之间，处于可以接受的范围，因此该⽅法可适⽤于抑制剂 的⾼通量筛选。 1.2 检检测测ADP的的⽣⽣成成量量 该类⽅法较易检测⼀些⾮多肽底物的激酶活性，如脂激酶，同时也可以测定⼀些ATP酶的活性。该类⽅法⼜可以分为A DP偶 联反应，即将A DP转化成其他物质并进⾏检测，例如Promega的A DPGloTM；依靠A DP抗体检测的⽅法，例 如Invitrogen的Adapta® ，Cisbio的Transcreener®等⽅法； 1.2.1 ADP-GloTM A DP-Glo™(原理见图1)是Promega公司开发的⼀种发光法激酶检测⽅式，检测激酶反应中所形成的A DP的量来反应激酶活 性。在该检测⽅法中，激酶反应中剩余的ATP会⾸先被A DP-Glo试剂消耗掉；接下来，激酶反应中⽣成的A DP则会被激酶检 测试剂还原成ATP ；然后，ATP在Ultra-Glo™萤光素酶的作⽤下，与荧光素反应发光，发光信号与激酶活性正相关。A DP- Glo™可⽤于检测⼏乎任何可⽣成A DP的酶的活性，不需要抗体参与以及放射性标记。这种检测⽅法相当敏感，能够检测到 的A DP的浓度下限为20 nM。Liu等利⽤A DP-GloTM技术筛选得到了CK2的抑制剂⾹⾖雌酚，并分析了抑制剂的机制。 1.2.2 其其他他检检测测ADP⽣⽣成成量量的的⽅⽅法法 除了Promega公司的A DP-GloTM以外，很多其他公司也开发了类似检测⽅法，譬如DiscoveRx公司的A DP Hunter™、Cisbio公司的Transcreener™以及Life technologies公司的Adapta™。其中A DP Hunter™可以利⽤激酶反应中产⽣ 的A DP，将phosphoenolpyruvate, PEP转化为pyruvate，并最终转化为荧光信号。该⽅法可以实时监测激酶的活性变化。 ⽽Transcreener™和Adapta™则是在A DP的特异性单克隆抗体上标记铕(Eu)原⼦，同时再使⽤d2或者AlexaFluour647等荧光 分⼦标记的A DP来竞争激酶反应的产物A DP，⽤于检测A DP的⽣成量。 1.2.3 检检测测ADP⽣⽣成成量量的的⽅⽅法法的的优优缺缺点点 这些检测A DP的⽅法，其优点在于：(1)检测产物⽽⾮底物，因此灵敏度要远远⾼于检测ATP消耗量的Kinase-Glo™ ；(2)不仅 可以应⽤于蛋⽩激酶的活性检测，同时糖激酶、脂激酶、ATP酶也可以使⽤此类⽅法进⾏活性测定；( )由于很多激酶本⾝有 内在ATP酶的活性，因此在反应体系中可以考虑不使⽤多肽底物，从⽽降低成本。当然，这些⽅法也有⼀些相对不⾜之处，如 易受到ATP酶活性的⼲扰，不能测定活细胞内激酶的活性等。 1.3 检检测测带带标标记记或或者者修修饰饰的的多多肽肽产产物物 虽然上 ⽅法可以检测激酶活性，但更多的公司选择对多肽底物进⾏各种修饰，并应⽤荧光技术进⾏检测，如荧光偏 振(Fluorescence Polarization, FP)、荧光共轭能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)、时间分辨荧 光(Time-resolved fluorescen