实验一 酵母RNA的提取及含量测定(紫外吸收法).doc

1 实验一 酵母RNA的提取及含量测定 一、实验目的与要求 1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。 2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法， 3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。 二、实验原理 由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。 酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。 在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。 核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH 和离子 2 强度发生变化。RNA 溶液（pH = 7.0）的ε（ρ）= 7 700-7 800，RNA 的含磷量为9.5%，含1μg /mL RNA 溶液的光密度为0.022-0.024。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3μg/mL 的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小。 蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 波长处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中的蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。 三、主要仪器和试剂 试剂：啤酒酵母粉、0.04M NaOH溶液、95%乙醇、乙醚、酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL HCl。 仪器：紫外分光光度计、离心机、真空干燥箱、三角瓶、烧杯、水浴锅。 四、实验步骤 1、称取5g干酵母粉，用30mL 0.04M NaOH溶液分步在研钵中研磨均匀后，转入2支50ml比色管，沸水浴加热35min，冷却，转入离心管，4000r/min，离心15min，将上清慢慢倾入装有10mL酸性乙醇的离心管，边加边搅动。 2、加毕，静置，待RNA沉淀完全后，5000r/min离心5min。弃去上清液。用95％乙醇分步将沉淀转移至布氏漏斗抽滤并洗涤，消耗95％乙醇体积总约30ml； 3、再用乙醚洗涤沉淀两次，消耗体积总约20ml，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量（减去滤纸重量），并记录该数据。 4、RNA粗品中RNA纯度测定：将样品配制成含5～50μg核酸/mL的溶液：将上述RNA粗品溶解于100ml容量瓶，定容，静置，取上清液于紫外分光光度计上测定260nm吸收值，按下式计算纯品RNA浓度。若O.D260读数过大，则根据O.D260值再做适当稀释。 五、计算： O.D260－260nm 波长处的光密度读数； L－为比色杯的厚度，一般为1或0.5； 0.024为1μgRNA/mL的光密度； 结果 RNA浓度=O.D260/0.024×L=0.386/0.024μg/mL=16×10^-6 g/ml 干酵母粉RNA含量=RNA重/干酵母称重×100% =16×10^-6 g/ml×100ml/5g×100% =0.032% 七、思考题 1.破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行? 答：由于酵母细