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黄柏对人胃癌细胞的光学效应 中药常用抗癌药物。在对中草药抗癌光敏剂的筛选中,发现黄柏提取液具有较强荧光性。本实验进一步探讨了黄柏对BGC823人胃癌细胞是否有光动力学杀伤效应及其细胞学机制,为中草药在肿瘤光动力学疗法(PDT)领域中的应用提供参考。 1 细胞活力检测 黄柏提取液的制备方法和浓度确定见文献。 常规培养BGC823人胃癌细胞(由北京医科大学附属人民医院提供)。 光敏实验条件和实验处理:实验组:加药照光;对照组:加药不照光。染色体观察另设空白对照组。光波长:480 nm和650 nm,其他同参考文献。 观察指标和取材:①噻唑蓝(MTT)代谢比色法:以了解癌细胞代谢活力状态,细胞在光敏化后24 h和48 h分别取材检测。②癌细胞生长曲线:按常规观察7 d。③癌细胞3H-TdR掺入量脉冲值测定(美国产Backman LS 3801液闪仪):细胞光敏化后24 h取材。④染色体观察:对M期、S期癌细胞行光敏实验后,前者立刻按常规收集染色体,后者8 h后收集染色体、并滴片观察。⑤酸性磷酸酶(ACP)和琥珀酸脱氢酶染色:连续观察3 d。⑥透射电镜(JEM 100CX-Ⅱ型,日本产)观察:光敏实验后72 h取材观察。 统计学方法:染色体观察结果用方差分析,3H-TdR掺入量测定用t检验,酶染色观察结果用χ2检验。 2 结果 2.1 不同浓度黄芪对bcg983细胞表达的抑制效应 在480 nm波长光照下,4 mL/L黄柏使光敏化后24 h的BGC823细胞MTT代谢OD值百分率降低了32%,随着药物体积浓度增高和作用时间延长,这种光敏抑制效应更明显。到48 h,1～100 mL/L黄柏均使MTT的OD明显下降。650 nm光照下,BGC823细胞光敏化后24 h,10 mL/L黄柏使MTT的OD值明显降低,48 h时,所有体积浓度的黄柏均导致细胞MTT的OD值明显下降(图1、2)。 4 mL/L黄柏对BGC823细胞光敏化后第3～7天生长抑制率达37.1%～66.6%(图3)。 2.2 体外染色体粘连试验 实验组BGC823细胞光敏化后24 h,3H-TdR掺入脉冲值百分率较对照组显著降低(P0.01,表1)。 染色体观察:对M期BGC823细胞进行光敏实验,证明黄柏10 mL/L和100 mL/L时,均未导致染色体粘连的光敏损伤,实验组和对照组染色体分散均好。S期BGC823细胞在光敏实验8 h后,染色体也未见粘连现象。但100 mL/L黄柏组进入中期分裂细胞为16%,较对照组(29%)明显减少(P0.01)。 2.3 acp阳性细胞百分率的变化 ACP染色:光敏实验后3个不同时期取材,都发现实验组癌细胞ACP阳性细胞百分率显著下降(P0.01,表2)。 琥珀酸脱氢酶染色:连续3 d的染色观察,实验组与对照组未见明显差异。2组细胞胞浆均见有广泛分布的酶染阳性的紫色小棒状或颗粒状物。 2.4 胞内核糖和胞内张力和细胞张力微丝 10 mL/L和100 mL/L黄柏对癌细胞超微结构有相似的影响。实验组均可见细胞内核糖颗粒明显减少,胞浆电子密度明显降低;线粒体嵴变少变形,线粒体肿胀甚至束泡变;粗面内质网明显扩张;核异染色质减少。此外,实验组细胞张力微丝明显减少。相比之下,100 mL/L黄柏导致细胞的这些损伤更明显。4 mL/L黄柏组细胞变化不明显。 3 不同浓度从光动力学角度解释bcg钢间的相互作用 本实验结果显示:黄柏在加药照光条件下,能使癌细胞的噻唑蓝代谢、癌细胞的生长均明显或持续性降低,提示黄柏对人癌细胞的确具有光动力学抑制效应。 黄柏在15～30 min内就能被活细胞摄取,并广泛分布到胞浆、胞核。本实验进一步观察到黄柏在细胞潴留的部位造成相应的光敏损伤。在胞浆,黄柏使癌细胞线粒体、内质网肿胀扩张,证明黄柏光敏作用的重点靶部位与血卟啉一致,仍是生物膜。此外,实验组ACP受抑制(P0.01)也可能涉及溶酶体膜损伤,继而溶酶体崩解导致细胞死亡。然而琥珀酸脱氢酶在实验组和对照组未见明显差异,说明线粒体在黄柏体积浓度为10 mL/L时,其损伤以肿胀为特点,却仍能维持一定程度代谢,暂时不足以造成整个细胞线粒体功能受阻的趋势。 据报道荧光剂吖啶橙使人肝癌细胞光敏化后,细胞的染色体发生粘连变性,从而导致分裂障碍。本实验对M期S期细胞加药照光后,细胞染色体均未见粘连变性,且分散好。但黄柏100 mL/L组光敏化的S期细胞能重新分裂的细胞百分率显著降低(P0.01)。同时,液闪仪测定实验组癌细胞的3H-TdR掺入脉冲值明显低于对照组(P0.01),从DNA合成受阻角度,再次证明黄柏对BGC823细胞S期有明显的光动力学抑制效应。 临床上光动力学疗法广泛用于体表、体腔或消化道肿瘤的治疗,而这些部位与黄柏抗癌作用的部位有些一致性。因此,在病人服用黄柏