Trizol法提取RNA实验步骤及原理.docx

Trizoｌ法使用步骤 一、分离纯化得基本原理 研究基因得表达与调控时常常要从组织与细胞中分离与纯化ＲＮA。ＲNA质量得高低常常影响cＤNA库,ＲT-PCＲ与Ｎorthern Ｂloｔ等分子生物学实验得成败。Ｔ rizol就是一种新型总ＲNＡ抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出得核酸酶。 二、用户需自备得试剂与材料 无水乙醇、氯仿、Ｇ lycｏgen(可能需要)、 1、５ｍｌ Eppeｎｄｏrf管(Ｒ Nase-frｅe)、 Tips(ＲNase－free) 三、准备工作 RNａse酶非常稳定,就是导致ＲNＡ降解最主要得物质。它在一些极端得条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。用常规得高温高压蒸气灭菌方法与蛋白抑制剂都不能就是ＲＮase完全失活。它广泛存在于人得皮肤上,因此,在与RＮA制备有关得分子生物学实验时,必须戴手套。 RNase得又一污染源就是取液器,根据取液器制造商得要求对取液器进行处理。一般情况下采用用ＤEPC（焦炭酸二磷脂,一种ＲＮａse抑制剂)配制得7０％乙醇擦洗取液器得内部与外部,基本达到要求。取ＲＮａｓｅ－free得物品时必须戴手套。 1、 料制品得处理 尽可能使用无菌,一次性塑料制品，已标明RNasｅ-Fｒee 得塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品 ,原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下: 在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEＰＣ使DEＰC得终浓度为０、1%。注意:DEP Ｃ为剧毒物,活性很强，小心在通风柜中使用。 处理得塑料制品放入一个可以高温灭菌得容器中 ,注入ＤEPC水溶液,使塑料制品得所有部分都浸泡到溶液中。 在通风柜中室温处理过夜。 将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已ＤEＰＣ水处理过得塑料制品得 烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。 5）烘箱用合适得温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 2、 璃玻与金属物品 250°C烘烤3小时以上。四、从组织中提取总ＲNA １）液氮研磨:组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮,再研磨,如此三次,按50-100mｇ组织/ｍｌ Ｔrｉzｏl加入Trｉzol，转入离心管进行第２步操作。 (液氮既能使各种组织成分不易被破坏或降解,又能使组织变硬,脆性增加易于磨碎。终止细胞内外一切生物反应，防止RＮA酶得降解反应) ２) 匀浆:组织样品按５0-10０ｍg/mlＴｒizoｌ 加入Triｚｏl。另外,组织体积不能超过Ｔriｚol体积得10%，否则匀浆效果会不好,用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。 五、从细胞中提取总RNA 1） 培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizｏl进行消化、裂解,Trizol体积按10 ｃm2/ml比例加入。 2) 悬浮细胞可直接收集、裂解，每１ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞,或1０7细菌细胞。 六、操作步骤 １、细胞或组织加Trizoｌ后，室温放置5min,使其充分裂解。注:此时可放入-70℃ 长期保持。 2、12，000rpｍ 离心5min，弃沉淀。 3、按２００ul氯仿/ml Trizoｌ加入氯仿,振荡混匀后室温放置1５min。注:禁用漩涡振荡器,以免基因组DＮA断裂。 (氯仿为有机溶剂,有效得使有机相与无机相迅速分离。有机相中主要就是酚与蛋白结合,从而使得蛋白与RＮA脱离，RＮA进入水相) 4、4℃ １2,０00g离心15ｍin。 ５、吸取上层水相,至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DＮA 与蛋白质,则保留下层酚相存于4℃冰箱，若只提RNA，则弃下层酚相。 6、按0、5ml异丙醇/ｍl Tｒizol 加入异丙醇(沉淀RNＡ）混匀,室温放置5-10miｎ。 7、４℃ 12,０00g离心１０min，弃上清,RNA沉于管底。 8、按1ｍl 75%乙醇／ｍｌ Tｒizol加入７５%乙醇(沉淀ＲNA),温与振荡离心管, 悬浮沉淀。 9、 4℃ 8,0０0g离心５mｉn，尽量弃上清。 10、室温晾干或真空干燥５－１0ｍin。注:RNＡ样品不要过于干燥，否则很难溶解。１1、可用５0ul Ｈ O,TE ｂuffer或０、5%SDS溶解RＮA样品,55－60℃,5-10ｍin。 2 注：H Ｏ、TE或0、5%SDS均须用DEPC处理并高压。 2 (TＥ缓冲液由Ｔｒis与EDTA配制而成,主要用于溶解核酸,能稳定储存DNA与RNA。用于酶切反应不能使用SDS) 12、测O、Ｄ值定量RNA 浓度。注:此方法提取 RNA A ／A 值在１、6-１、8 之间; 260 ２80 产率估计:组织标本:(ug RNA/ｍg 组织）1-10ｕg,培养细胞(ug ＲNA／１06 ｌ):５-1５ug。 Cｅ