透明颤菌血红蛋白的DNA改组研究.docVIP

透明颤菌血红蛋白的DNA改组研究 透明颤菌血红蛋白的DNA改组研 袁宁胡叉佳朱眷宝(朱宝泉 (上海医药究 工业研究院，上海200437) 为提高透明颤菌血红蛋白在限氧条件下促进宿主细胞生长的能力，首先通过易错PCRI句透明颤 血红蛋白基因中引入突变，再结合DNA改组对之进行改造。 菌 将改组基因置于透明颤菌血红蛋白天然启动子下游，转化大肠杆菌DH5a，构建改组文库，以限 氧培养条件下菌体沉淀的颜色为指标进行试管初筛，再以限氧和极端限氧条件下菌体湿重为指标进 行摇瓶复筛，最终得到一个高活性突变蛋VHb?042506。该蛋白使宿主的菌体湿重在限氧和极端限 氧条件下较原基因转化子分别提高T3i(25,和58(755。经测序和比对，该基因与原基因相比发生了 11处碱基突变，致氮基酸突变4处。co差光谱实验显示该蛋白具有更强的特征吸收? 透明颤菌 (Fitreoscil]a)是一种专性好氧的丝状革兰氏阴?|生细菌，可在池沼或腐烂的蔬菜中 分离到。作为专性好氧菌，透明颤菌之所以能在贫氧的环境中生存(是因为其能够合成透明颤菌血 红蛋白(gitreosci]]ahemoglobin(简称为v}Ib，编码基因称为vgb)的缘故。将此蛋白在异源微生 物、植物乃至动物细胞中进行表达，发现其具有在限氧条件下促进宿主细胞生长、提高抗生素、酶 或其他经济产物产量、增强植物抗涝能力、加速微生物对环境污染物分解等作用。目前，VHb应用 于发酵、重组蛋白表达、转基因动植物、环保等诸多领域，取得了显著成效。近年来，对VHb的改造 也已展开(其中采用了定点突变、易错PCR(error-prone PCR)、根据宿主密码子偏向性进行全合成 等方法，获得了一些活性提高或更适应宿主的“新”VHb。 以DNA改组(ONA 为代表的蛋白体外定向进化是近年来兴起的一项蛋白质工程新技 shuffling) 术，它模拟达尔文进化的方式(通过将单个基因或不同来源的基因家族打碎后进行重组，使亲本的 不同信息快速交换和累积。再辅以高效快速的筛选方法，就能在短时间内获得性状、活性发生有益 改变的新基因。因而是一种“有性”基因突交。相比于。无性?基因突变，DNA改组具有突变频率大、正 向突变率高、跨越物种界限、亲本性状快速富集等优点，因而得到了广泛应用并在许多酶、疫苗以 及其他一些蛋白的改造中获得了成功。 本研究将易错PCR与DNA改组相结合，对VHb进行改造，并将突变基因置于受氧调控的启动子之下 进行表达和筛选(来筛选在限氧条件下比VHb具有更强生长促进作用的突变蛋白。 1材料与方法 1(1材料 1(1(1菌株和质粒大肠杆菌,coli DH5a、载体pUCl8、pUCl9vgb(由长1(4kb的曙趿其天然启动子 序列与pUCl9连接得到)由本实验室保存。 1-1(2培养基、酶及试剂大肠杆菌LB;和TB培养基参考文献”，使用前添加氨苄青霉素至终浓度lOOpg,mL， DNA DNA 固体培养基添加2嘲i脂:Taq 、dNTPs、DNase I、T4 Ligase、限制性内切酶均Polymerase 自TAKARA公司;DNA小片段快速回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。 购 1(1(3引物PCRBI物由上海博亚生物技术有限公司合成，序列如下所示(其中下划线为酶切位点。 VHI:5?-Gc!盟堑?TTA竹cAAccGcTl?AGcGT_3? mhI 、，}12:5-cG丛幽 ATGTTAGACCAGCAAACCA一3? 屁。R I Pvgbl:5-CG?丛卫凹TccTTAAGTTcATTATTATGG_3? ZcoRI Pvgb2:5-^^^?Q16堕CAcCAGTcACAG从从GcAT 一3? ScaI 1(2方法 1(2(1 co]i DNA酶切、分离、回收、连接等常规操作参考文献”，质粒转化E DH50采用化学法。 1(2(2克隆和表达载体构建以pUCl9，咖为模板(VHI和VH2为引物PCR扩增增6结构基因(反应条件 为: 94C变性imin，94?30s，5TC30s，72C40s，循环30次后，72C延{申5min(PCR产物经1,琼脂 胶电泳分离、回收500bp附近的片段，经屁珠I和Xba I双酶切后连入经同样双酶切的pUCl8，糖凝 pUCl8vgb。再以pUCl9哪为模板，Pvgbl和Pvgb2为引物PCR扩增曙6启动子部分(，反应条件得到 为94C变 性imin，94C30s，54C30s，72U2min，循环30次后，72?延{申5min。电泳回收1(8kb的片 段，经助球 I和日I酶切后连入经同样双酶切的pUCl8 vgb，得到克隆和表达载体pYG857( 1(2(3易错PCR以pYG857模板。VHl和VH2为引物扩