SN_T 3576-2013转基因成分检测 大豆PCR-DHPLC检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3576—2013转基因成分检测大豆 PCR-DHPLC检测方法Detection of genetically modified components-Method for soybean using PCR-DHPLC2013-03-01 发布2013-09-16 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂溪查真伪 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准转基因成分检测大豆 PCR-DHPLC检测方法SN/T 3576-2013*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：(010址 www. spc. net. cn中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×1230　1/16印张 0.55字数 10千字2013年8月第一版　2013年8月第一次印刷印数 1—1600*书号：155066·2-25779 SN/T 3576--2013前 言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中国检验检疫科学研究院、深圳博睿祥晖生物技术有限公司、国家纳米科学中心、辽宁农业科学研究院。本标准主要起草人：章桂明、朱水芳、向才玉、程颖慧、凌杏园、汪朝晖、朱劲松、黄新、欧阳辉、王颖、仲建忠、缪建锟。I SN/T 3576--2013转基因成分检测大豆 PCR-DHPLC检测方法1 范围本标准规定了大豆中转基因成分的PCR-DHPLC检测方法。本标准适用于转基因大豆（roundup ready soybean,RRS)中的转基因成分的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验分法GB/T19495.7转基因产品检测，抽样和制样方法SN/T 1193基因检验实验室技术要求3原理变性高效液相色谱技术(denaturing high-performence liquid chromatography,DHPLC)是一种简单、快速、非凝胶的核酸分析方法，在50C条件分析样品，出碱基对的数量决定样品峰的洗脱顺序，当过柱的乙浓度提高，核酸片段会根据相对分子质量欣小到大的顺序被洗脱出来。本标准采用多重PCR方法针对转基因大豆含有的转基因成分同时进行扩增，扩增产物用DHIPILC进行分析，通过DHPLC得到的洗脱峰与marker比较确定相对分子质量大小，判定是否带有外源基因成分及是否为转基因大豆。4　设备、用具及试剂4.1设备及用具组织粉碎机、PCR仪、DHPLC仪、永浴锅、电子夫平（精度：1/1.000以上）、普通离心机、低温冷冻高速离心机、冰箱、低温冰箱、制冰机、恒温干燥箱、pH计、移液器（0.1 μL,0.5 μL,2 μL，10 μL,20 μL，100μL,200 μL,1000 μL）、紫外可见分光光度计、纯水机、高压消毒锅、PCR管(0.2 mL）、离心管（1.5ml，2. 0 mL)、Tip 头(0. 1 μL-10 μL,5 μL~200 μL,100 μL~500 μL)。4.2试剂CTAB提取液、Tris 饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、70%乙醇、RNA酶(10 mg/mL）、多重PCR反应液缓冲液(Multiplex PCR Mix)、Tag DNA 聚合酶,DHPLC缓冲液 A:TEAA(0.1 mol/L,pH7.0)、乙腈(0.025%）,DHPLC缓冲液B:TEAA（0.1mol/L,pH7.0)、乙腈（25%）,DHPLC缓冲液D:乙腈(75%，pH7.0）、分子量标记(marker)。5抽样与制样按照GB/T 19495.7进行。 SN/T 3576—20136DNA 提取及浓度测定6.1 DNA 提取6.1.1 CTAB方法CTAB方法步骤如下:a）称取150mg磨碎的样品，迅速转人2mL离心管中，加65℃预热的CTAB提取液700μL，混勾，放入65℃水浴锅中水浴30min;b）加 5 μL RNase(10 mg/mI.),37 ℃水浴 30 min;c）加人等体积Tris 饱和酚，充分混匀，12 000 r/min离心15 min;d）j取上清液，加人等体积的三氟甲烷/异戊醇（24：1)混勾.12000r/min离心10min.重复该步骤1次；e）加人等体积预冷的异丙醇，轻轻摇晃，置于一20