SN_T 2497.15-2010进出口危险化学品安全试验方法 第15部分：PCR-SSCP实验.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2497.15-2010进出口危险化学品安全试验方法第 15部分：PCR-SSCP实验Test method of import and export dangerous chemicals--Part 15: Test of PCR-SSCP2010-03-02发布2010-09-16实施M中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 2497.15-—2010前言SN/T2497《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为29部分：第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验；第2部分：空斑形成细胞（PFC)试验；第3部分：大型繁殖试验；第4部分：酿酒醇酵母有丝分裂重组试验；一第5部分：睾丸细胞UDS试验；第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；一第7部分：小鼠耳肿胀试验；第8部分：瞩窝淋巴结试验：第9部分：血清溶血素测定试验；第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验；第11部分：种系突变试验；第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验；第13部分：荧光原位杂交试验；-第14部分：SDS-聚丙烯胺凝胶电泳试验；第15部分：PCR-SSCP实验；第16部分：Western-Blot实验；第17部分：哺乳动物行为毒理学试验；第18部分：DNA加合物的检测方法；第19部分：NorthernBlot实验；第20部分：Bradford法测定蛋白质含量；第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验；第22部分：DNA的Tm值测定方法；第23部分：细胞器的分离实验方法；第24部分：细胞免疫功能体外检测方法；-第25部分：体液免疫功能试验；第26部分：巨噬细胞功能试验；第27部分：流式细胞术检测调亡；第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；-第29部分：生化需氧量（BOD)测定。本部分为SN/T2497系列标准的第15部分。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口，本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：于艳军、王利兵、王华、陈春、李学洋、赵黎华。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。1 SN/T2497.15--2010进出口危险化学品安全试验方法第15部分：PCR-SSCP实验1范围SN/T2497的本部分规定了进出口危险化学品PCR-SSCP实验的主要试剂和材料、主要仪器设备、试验步骤和试验结果。本部分适用于可能引起DNA片段中碱基突变的进出口危险化学品的筛查。2术语、定义和缩略语2.1术语和定义下列术语和定义适用于本部分。2. 1. 1基因突变genemutation由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或改变而引起的基因结构的改变。2.2缩略语下列缩略语适用于本部分。2.2.1PCR聚合酶链式反应2.2.2SSCP单链构象多态性2.2.3TEMEDN,N,N,N-四甲基乙二胺3原理单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。该方法为单链构象多态性分析。将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，即为PCR-SSCP技术。4试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水为灭菌蒸馏水或超纯水。4.130%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g，N,N-亚甲双丙烯酰胺1g，加蒸馏水至60mL，加热至37℃溶解，补加水至终体积为100ml，过滤除菌。4.25×TBE:54gTris碱,27.5g硼酸,20mL0.5mmol/LEDTA，调节pH值至8.0。4.310%过硫酸铵：1g过硫酸铵溶于10mL水中，4℃保存数周。4.4 TEMED.4.56×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油水溶液，4℃保存。 SN/T2497.15---20105仪器设备5.1电泳仪5.2聚丙烯凝胶电泳槽。6试验步骤6.1PCR反应液总体积为10uL：在PCR管中加入下列反应成分：a)10X Buffer 1 μl.;b)dNTP 70 μmol/L:c）DNA模板100ng。引物及TaqDNA聚合酶依实验设计要求按比例加人a) a-2p-dCTp 0.1 μl(1 μCb）加ddH0至10μL按实验设计循环参数进行扩增，获取扩增产物6.2聚丙烯胺凝胶制备根据分离的DNA片段的大小不同按表1和表2配制不同浓度的丙烯酰胺凝胶溶液。每100mL丙烯酰胺凝胶溶液加35uLTEMED，混匀，立即铺胶，插人梳子于室温聚合60min。表1DNA在聚丙烯