SC_T 7226-2017鲑甲病毒感染诊断规程.pdf

ICS 65.020.30B 41SC中华人民共和国水产行业标准SC/T 7226—2017鲑甲病毒感染诊断规程Diagnostic protocol for salmonid alphavirus2017-06-12发布2017-10-01实施中华人民共和国农业部发布 SC/T7226—2017前言本标准按照GB/T1.1-—2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由农业部渔业渔政管理局提出。本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。本标准起草单位：东北农业大学、全国水产技术推广总站、中国检验检疫科学研究院、北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘敏、余卫忠、吕永辉、江育林、张利峰、任彤。1 SC/T7226-—2017鲑甲病毒感染诊断规程1范围本标准给出了鲑甲病毒感染的临床症状检查，规定了样品采集及处理、病毒分离、病毒鉴定及结果的综合判定的方法。本标准适用于鲑甲病毒感染鲑科鱼类引起的胰脏病和昏睡病的流行病学调查、疾病诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范3缩略语下列缩略语适用于本文件。CHSE-214：大鳞大马哈鱼胚胎细胞系（Chinooksalmonembryocellline）CPE：细胞病变效应(Cytopathic effect)DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate)dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate)FCS：胎牛血清（Fetalcalfserum）RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction)SAV：鲑甲病毒（Salmonid alphavirus）4试剂和材料4.1水：应符合GB/T6682中一级标准水。4.2SAV参考株：由农业部指定的动物病原微生物菌(毒)种保藏机构提供。4.3CHSE-214细胞。4.4Trizol试剂，4℃保存。4.5M-MLV反转录酶（200U），一20℃保存。4.6DNA分子量标准：DL2000。4.7溴化乙锭。4.8琼脂糖：电泳级。4.9dNTP:10mmol/L，一20℃保存。4.10TaqDNA聚合酶：5U/μL，一20℃保存。4.11RNA酶抑制剂（40U/μL），—20℃保存。4. 122TBE电泳缓冲液（5倍浓缩液）：配方按附录A中A.1的规定执行。4.13引物：用TE缓冲液或无菌去离子水配置成10μmol/L，一20℃保存；扩增大小为516bp。引物序1 SC/T 7226—2017列如下：E2F: 5-CCG-TTG-CGG-CCA-CAC-TGG-ATG-3E2R: 5-CCT-CAT-AGG- TGA- TCG-ACG-GCA-G-34.14磷酸盐缓冲液（PBS)：0.01mol/L，配方按附录A.2的规定执行。4.15L-15或EMEM细胞培养液。4. 166胎牛血清。4.17无水乙醇：分析纯。4.18普通琼脂糖凝胶DNA电泳6倍上样缓冲液。5仪器和设备5.1高速冷冻离心机：4℃转速12000g以上。5. 2—20℃冰箱。5.3PCR仪。5.4核酸电泳仪和水平电泳槽：输出直流电压0V~600V。5.5凝胶成像仪。5.6可控温水浴锅或恒温金属浴。5.7微波炉。5.8生化培养箱。5.9涡旋振荡器。5.10超净台。5.11组织匀浆器。5. 122倒置显微镜。65流行情况与主要临床症状参见附录B。7采样7.1采样对象、鳟等易感鱼类。7.2采样水温与数量应在水温低于18℃进行，采样数量应符合SC/T7103的要求。7.3样品采集在渔场收集患病的、死亡的、体弱的和行为不正常的，特别是在网箱底部昏睡不动的鱼；采集心脏、鳃、胰腺和骨骼肌。对有临床症状的鱼，体长4cm的鱼苗取整条，带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊；体长4cm～6cm的鱼苗取所有内脏；体长6cm的鱼取心脏、胰脏、鳃和骨骼肌。对无症状的鱼取心脏、胰脏和骨骼肌。取样数量按GB/T18088的规定执行。8病毒分离和鉴定8.1病毒分离培养8.1.1样品处理SAV的分离，每5尾鱼为1个样品，若有症状成鱼每1尾为1个样品。先用组织匀浆器将样品匀2 SC/T7226—2017浆成糊状。再按1：10的最终稀释度重悬于L-15或EMEM培养液中。将样品匀浆后再悬浮于含有1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链