SN_T 4729-2016杜鹃芽枯病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4729-2016杜鹃芽枯病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Seifertia azaleae (Peck) Partridge and Morgan-Jones2016-12-12 发布2017-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4729-2016前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准起草人：吴品珊、杜洪忠、雷荣、邵思、严进、张秋娥。1 SN/T 4729—2016杜鹃芽枯病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了杜鹃芽枯病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于针对杜鹃属（RhododendronL.）植物的花芽、叶芽和嫩枝中携带的杜鹃芽枯病菌的检疫鉴定。2病菌的基本信息学名：Seifertiaazaleae(Peck)PartridgeandMorgan-Jones英文名：Bud blight,Bud andtwigblight分类地位：真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，散囊菌纲Eurotiomycetes，刺盾目Chaetothyri-ales，小蔓毛壳科Herpotrichiellaceae。传播途径：病菌主要在病芽上存留或越冬。翌年由芽鳞基部侵入寄主，并进人髓部，阻碍梢枝水分输导，使芽、梢枯菱。近距离主要由媒介昆虫如叶蝉、密蜂等和雨水滴溅传播。远距离传播主要通过带病植株传播。杜鹃芽枯病菌的其他信息参见附录A。3方法原理以杜鹃芽枯病菌的形态学特征和ITS基因序列比对特征为鉴定依据。4仪器设备和用具4.1仪器设备生物显微镜（具测量功能）、体视显微镜、超净工作台、生物培养箱、天平、高压灭菌锅、台式高速离心机、pH计、水浴箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪。4.2用具烧杯、锥形瓶、量筒、试管、培养皿、酒精灯、镊子、剪刀、解剖刀、接种针、载玻片、盖玻片、塑料研杆、移液器、移液器吸头、离心管、液氮罐。5试剂和培养基5.1试剂葡萄糖、琼脂粉、次氯酸钠、硫酸链霉素、液氮、Tris-HCI、MgCl2、HC1、EDTA、NaOH、NaOAC、KCl、Tris、CTAB、TAE、无水乙醇（Ethanol）、苯酚（Phenol）、溴化乙锭（EB）、氯仿（Chloroform）、异丙醇（Isopropanol）、异戊醇（Isoamylalcohol）、蛋白酶K、TaqDNA聚合酶、dNTPs、引物ITS5/ITS4。I SN/T4729-20165.2培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），链霉素马铃薯葡萄糖琼脂培养基（SPDA）。具体配方参见附录B。6检疫鉴定方法6.1症状检查观察杜鹃花的花芽是否有变褐、水浸状或枯萎症状，芽鳞外面是否有小黑点。检查嫩枝是否有枯萎的症状。病害症状参见附录A和附录C。6.2分离培养取疑似症状的杜鹃花的花芽和嫩枝，分别用0.5%次氯酸钠表面消毒1min，灭菌水冲洗3次，置于含链霉素的SPDA培养基平皿中，20℃培养，3d～5d开始后观察。待真菌菌落出现，取菌落边缘菌丝，转移至PDA上纯化3次备用。6.3形态学鉴定在PDA上培养一周后观测菌落的特征，记录分生孢子、产孢细胞形状、大小等。培养皿至少观察5周至7周。6.4分子生物学鉴定6.4.1DNA提取按CTAB方法提取DNA参见附录D6.4.2PCR反应及序列比对利用真菌通用弓|物ITS5（5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）进行扩增。25μL反应体系中含：样品DNA1μL（1ng～50ng），10×PCRbuffer2.5μL，25mmol/LMgCl22μL,2.5mmol/LdNTps2μL,10μmol/LPrimers各0.5μL,5U/μLTaqDNApoLymerase0.2μL，ddH²O16.3μL。同时要设置阴性对照，以Tris-EDTA缓冲液代替DNA样品。PCR反应条件为：预变性，94℃4min-→变性，95℃1min，退火56℃30s、72℃45s，35个循环→72℃10min-→4℃保存。PCR产物的检测在1XTAE电泳缓冲液中，1.5%琼脂糖凝胶电泳，5V/cm，0.5%EB染色20min，凝胶成像仪分析结果。如有目标片段大小的单带出现，将扩增产物进行序列测定。将测序获得的序列与美国国立生物技术信息中心（NCBI)网站DNA序列数据库(GenBank)中公开发表的Seifertiaazaleae的序列进行同源性比对分析。7鉴定特征7.1形态学特征杜鹃芽枯病菌在PDA培养基上的菌落呈橄榄色至深灰褐色，质地毛茸。杜鹃芽枯病菌的