SN_T 2693-2010马焦虫病检疫规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2693—2010代替SN/T1526—2005马焦虫病检疫规范Quarantine protocol for Equine piroplasmosis2011-05-01实施2010-11-01发布中华人民共和国30发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T2693—2010前 言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准代替SN/T1526一2005《马巴贝斯虫病检测方法：微量补体结合试验方法》。本标准与SN/T1526一2005相比，主要技术变化如下：一增加了马焦虫病的血液涂片镜检；增加了间接荧光抗体试验；增加了酶联免疫吸附试验，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王玉玲、陈本龙、柴铭骏。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1526—2005。 SN/T2693—2010马焦虫病检疫规范1范围本标准规定了马焦虫病的血涂片镜检、间接荧光抗体试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验等技术要求。本标准适用于马属动物的马焦虫病检疫、诊断和血清学调查2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3概述参见附录A。临床症状与病理变化4参见附录B。5被检血清样品采集5.1采血和分离按常规方法采血和分离血清。血清应新鲜，无明显蛋白凝固、无溶血、无腐败气味。5. 2运送和保存防止血清冻结和受热，若3d内不能送到实验室，应采用冷藏方法运送。血清应放至4℃冰箱内保存备用。6实验室诊断6.1血涂片镜检6.1.1仪器和设备普通显微镜。6.1.2试剂和材料姬姆萨染色液，配制方法参见附录C。 SN/T2693—20载玻片：处理方法参见附录C。6.1.3操作步骤血涂片制备无菌采集动物血液，取50μL滴于载玻片的一端约三分之一处，以一端边缘光滑的载波片为推片，将推片的一端置于血滴之前，待血液沿推片端缘扩散后，自右向左推成薄血膜。将血涂片置空气中干燥，用铅笔在载玻片的标签上编号，注明制片日期。血涂片染色将制备好的血涂片80℃热固定5min，再用5%姬姆萨染液染20min~30min。染色后涂片用自来水冲洗3次～4次，以除去附着的染料，但不能超过5s，否则样本会脱色。将血涂片空气干燥，先用低倍镜（如10×10)观察，再用100倍油镜下观察红细胞内是否有马焦虫裂殖子。6.1.4结果判定5μm，直径1.3μm~3.0μm；成对裂殖子两尖若见红细胞内的裂殖子呈梨籽形，长2um~端连接成锐角（参见附录D），则可确诊此动物为弩巴贝斯虫感染，判定该动物感染马焦虫病。若见红细胞内裂殖子相对较小，长度小于2μm～3μm，呈圆形或阿米巴样；成对的裂殖子尖营4个裂殖子组成四联体或马尔他十字形状（参见附录D），则可确诊端不连接，常成同端异向并列；通常此动物为马巴贝斯虫感染，判定该动物感染马焦虫病。若未见有和所描述特征的裂殖子，则宜借助其他试验进一步确诊。6.2间接荧光抗体试验S6.2.1仪器和设备台式离心机。冰柜：-80℃。磁力搅拌器。6.2.1. 4荧光显微镜。微量移液器。6.2.2试剂和材料PucksSalineG溶液（pH7.2)配制方法参见附录E。山羊血清。丙酮，分析纯。6.2.2. 4阳性对照血清。阴性对照血清。0.01mol/LpH7.4PBS配制方法见附录E。FITC荧光素标记的羊抗马IgG。真空管：容积15mL。载玻片。0粘质纸带。1锡箔纸。2干燥缸。2 SN/T2693—203染色缸。4指甲油。5一次性注射器：规格为1mL。6U型微量反应板。7·湿盒。6.2.3操作步骤抗原片制作.1当已知感染马焦虫病动物红细胞染虫率达2%~5%时，采集全血，冷藏方法送至实验室。.2将装有全血的真空管置台式离心机内4℃,2000r/min离心15min，用微量移液器吸弃上清液和白细胞层。.3向真空管中加入PucksSalineG溶液，用移液器轻柔地反复吹打沉积的红细胞层，至重新悬浮红细胞后，4℃，2000r/min离心15min，用微量移液器吸弃上清液和白细胞层。依此法重复两次。.4用含有10%山羊血清的PucksSalineG溶液重新悬浮红细胞，使血球沉积量占血球悬浮液总量的三分之一。即如果沉积的血球量为5mL，则应加人含有10%山羊血清的PucksSalineG溶10mL。.5取8μL的红细胞悬浮液滴在载玻片的一末段。再拿另一载玻片，将其倾斜45°角左右，慢慢地将红细胞液滴推向载玻片的另一段，使载玻片均匀地涂有一薄层血液，并将其置空气中晾干。即得抗原片。.6依此