SNT 2071-2008亚洲柑橘黄龙病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2071-2008亚洲柑桔黄龙病菌检疫鉴定方法Identification of Candidatus liberobacter asiaticum2008-11-01 实施2008-04-29发布中华人民共和国H0?发布*这疗转素查调反国家质量监督检验检疫总局数码防伪 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准亚洲柑桔黄龙病菌检疫鉴定方法SN/T 2071—2008*中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www. spc. net. cn电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷广印刷*开本 880×12301/16印张 0.5　字数8千字2008年7月第一版　2008年7月第-次印刷印数 12 000*书号：155066·2-18942 SN/T 2071-2008前言本标准的附录 A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中国检验检疫科学院动植物检疫实验所。本标准主要起草人：李今中、王念武、周卫川、朱水芳、林阳武。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2071—2008亚洲柑桔黄龙病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了进出境植物检疫中亚洲柑桔黄龙病菌的检疫和鉴定方法。本标适用于进出境柑桔种子、苗木等寄主繁殖材料和柑桔水果类等植物产品中亚洲柑桔黄龙病菌的检疫和鉴定。2 原理2.1亚洲柑桔黄龙病菌分类地位亚洲柑桔黄龙病菌（Candidatus liberobacter asiaticum）属于薄壁菌门（Gracilicutes）韧皮部杆菌属(Liberobacter)亚洲型细菌。相关资料参见附录A。2.2＇检疫鉴定原理利用多聚酶链式反应（polymerase chain reaction)技术，进行亚洲柑桔黄龙病的检疫鉴定。PCR 产物进行测序和BLAST,用于区分亚洲柑桔黄龙病菌和其他两种柑桔黄龙病菌。3仪器3. 1研体。3. 2白瓷盘。3.3 pH计。3.4 PCR 管、Eppendorf 管(1.5 mL)。3.5移液枪（1000 μL可调、200 μL可调、20 μL可调、2.5μL可调）。3.6恒温水浴锅或恒温培养箱。3.7分析电子天平。3.8低温冷冻超速离心机、低速离心机。3. 9PCR扩增仪。3. 10电泳仪。3. 11凝胶成像仪。3. 12低温冰箱。3. 13高压灭菌锅。3. 14超净工作台。4试剂药品4.150 mmol/L 的 Tris-HCl.4.2 10 mmol/L EDTA(pH 8. 0)。4.3 0.2 mol/L氢氧化钠+1% SDS。4.4 0.5 mL 的乙酸钠(pH 4.8)。4.5 液氮。4.6 无水乙醇、双蒸水(DDW)。4.7 引物。4.8 10×PCR 缓冲液、Taq 多聚酶。 SN/T 2071--20084.9 dNTP,Marker。4.10　1.2%琼脂凝胶、EB。4.11 DNA纯化试剂盒。5亚洲柑桔黄龙病(Candidatus liberobacter asiaticum）的检测和鉴定5.1检验样品的准备症状检查:症状复杂，易与生理病害混淆,其典型症状为黄梢和斑驳。发病初期,病树部分新梢叶片不转绿而呈均匀黄化；叶片从主、侧脉附近或叶片基部边缘出现黄绿相同的斑驳，后期叶片均匀黄化、失去光泽，叶脉柄肿大，木栓化，硬脆而易脱落；果实小而呈畸形。检测样品：从待检样品中挑取有疑似症状的柑桔叶片叶脉约0.05g～0.1g，用无菌水冲洗净。阳性对照：取感病的柑桔叶脉0.05g～0.1g,用无菌水冲洗净。阴性对照：取健康的柑桔叶脉0.05g～0.1g，用无菌水冲洗净。5.2样品 DNA 提取将准备好的样品和阳性对照样品各0.05g～0.1g,剪碎后分置于研钵内，加液氮研磨成粉末，再加人 50 mmol/L 的 Tris-HC1,10 mmol/L EDTA(pH 8. 0)各 0. 4.mL,14 000 r/min离心5 min,取上清液0.5mL,加人等体积0.2mol/L 的氢氧化钠+1% SDS,摇匀，冰浴10min,再加入0.5mL的乙酸钠（pH 4.8),摇匀,冰浴5min,14000 r/min 离心5 min,取上清液0.5mL,加人1mL的无水乙醇，在一20℃下放置 2h,15000r/min离心15min，沉淀用75%乙醇洗2次，吹干，灭菌双蒸水 DDW溶解。注：如果采用市场所售的植物总DNA试剂盒提取，则按其公司提供的方法提取DNA。5.3 PCR 扩增5.3.1扩增引物上游引物 P1: 5-AGCGTTGTTCGGAATAACTGG-3下游引物 P2 :5-ACCTTCCTC