SN_T 3729.5-2013出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法 第5部分：木瓜成分检测　 实时荧光PCR法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3729.5—2013出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法第5部分：木瓜成分检测实时荧光 PCR 法Identification of fruit species in export food and drink-Part 5 : Detection of papaya ingredient---Real-time PCR method2013-11-06 发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3729.5—2013前言SN/T3729《出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法》共分为以下10个部分第1部分：草莓成分检测PCR 法;第2部分：杏成分检测实时荧光 PCR法;第3部分：梨成分检测实时荧光 PCR法；实时荧光PCR法；-第4部分·芒果成分检测-第5部分：木瓜成分检测实时荧光PCR法；实时荧光PCR法；-第6部分：苹果成分检测PCR法;-第7部分：葡萄成分检测第8部分：山楂成分检测实时荧光 PCR法；第9部分：桃成分检测实时荧光PCR法；第10部分：香蕉成分检测实时荧光PCR法。本部分为SN/T3729的第5部分本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本部分主要起草人：张舒亚、陈颖、高琴、刘月明、郑秋月、李富威、吴亚君、韩建勋。 SN/T 3729.5—2013出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法　第5部分：木瓜成分检测实时荧光 PCR 法1范围SN/T3729的本部分规定了出口食品和饮料(油、酒精等精加工食品除外）中木瓜（番木瓜）成分的实时荧光PCR检测方法。本部分适用于果汁、果酱及其他以水果为原辅料的食品中木瓜（木瓜）成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检出限（LOD)为1%（质量分数）2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。丸是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1木瓜 carica papaya番木瓜科番木瓜属植物，木瓜是俗称，学名番木瓜（papiya）。3.2清汁clarified juice经过澄清工艺加工，没有浑浊和沉淀的架汁。3.3浊汁 cloudy juice未经过澄清工艺加工，浑浊但未分层和沉淀的果汁4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）。dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）。CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide)。Tris:三(羟甲基)氨基甲烷Ltris(hydroxymethyl)aminomethane]。 SN/T 3729.52013EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)。Taq:水生栖热菌（Thermus aquaticu）。OD:光密度值(optical density)。5方法提要样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用木瓜的特异性检测引物和探针进行实进荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象，进行食品及饮料中木瓜成分的检测鉴定，其中以木瓜果肉DNA为阳性对照，以非木瓜来源的DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。6试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1检测用引物和探针：见表1。表 1引物探针序列引物/探针引物/探针序列（5-3）目的基因内参照5端引物CCTGAGAAACGGCTACCAT内参照3端引物CGTGTCAGGATTGGGTAAT真核生物18SrRNA基因内参照探针FAM-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-TAMRA木瓜5端引物AGTGGCTCAATATGGTATTCACTACAGA木瓜3端引物AAAATGTAGATATACCTCCCTTGAGCG木瓜 papain 基因木瓜探针FAM-ATACTTACCCATATGAGGGAGTGCAACGTTATTG6.2 CTAB 提取缓冲液:20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCI,0.02 mol/I. Na EDTApH CTAB沉淀液:5 g/L CTAB,40 m