SN_T 3741.2-2013国境口岸鼠类携带病原体检测方法 第2部分：土拉弗朗西斯菌PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3741.2-2013国境口岸鼠类携带病原体检测方法第2部分：土拉弗朗西斯菌PCR检测方法Detection for pathogens of rodents at frontier ports-Part 2:Detection for Francisella tularensis2013-11-06 发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局流梦到 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准国境口岸鼠类携带病原体检测方法第2部分：士拉弗朗西斯菌PCR检测方法SN/T 3741.2—2013*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029)北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×1230　1/16　印张 0.5　字数10千字2014年5月第一版　2014年5月第一次印刷印数 1—1 600*书号：155066·2-26951 SN/T 3741.2—2013前言SN/T3741《国境口岸鼠类携带病原体检测方法》共分为2部分：第1部分：致病性钩端螺旋体PCR检测方法；-第2部分：土拉弗朗西斯菌PCR检测方法。本部分为SN/T3741的第2部分。本部分按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国云南出人境检验检疫局。本部分主要起草人：孙肖红、刘丽娟、侯中生、刘键、罗忠鑫、杨学兵、胡克林、杨宇、胡孔新、王静。1 SN/T 3741.2--2013国境口岸鼠类携带病原体检测方法第2部分：土拉弗朗西斯菌PCR检测方法1范围SN/T 3741的本部分规定了国境口岸鼠类样本采集、处理方法、土拉弗朗西斯菌PCR检测的方法和结果判定。本部分适用于国境口岸鼠类携带病原体检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1鼠类rodent与鼠传疾病有关的鼠形动物（包括啮齿目、兔形目和食虫目动物）。3.2 土拉弗朗西斯菌Francisella tularensis属于弗朗西斯菌属（Francisella），是引起的土拉弗朗西斯菌病（Tularenmia）的病原体。土拉弗朗西斯菌病是一种人兽共患急性传染病，在多种野生动物中流行，人和动物通过接触染疫的动物或感染的水、气溶胶以及吸血昆虫（蜱、蚊、蛇)叮咬而感染和传播。野兔是土拉弗朗西斯菌病的主要宿主，人类常因捕猎或接触野兔而受到感染，所以本病又被称为“野兔热”。由于微量土拉弗朗西斯菌即可引起感染，故可以作为生物武器使用，因此备受重视。4　要求鼠类携带病原体检测应在生物安全2级以上实验室(BSL-2)内进行。实验室应遵循GB19489对生物安全2级及以上实验室的生物安全要求。5实验仪器设备主要仪器如下：高速台式冷冻离心机;—组织研磨仪；-生物安全柜；1 SN/T 3741.2--2013电泳仪；凝胶成像系统；PCR 仪;微量加样器(10 μl、20 μL、100 μL、200 μl、l 000 μL）);冰箱(2℃～8℃和-20℃～80℃）。6 主要试剂6.1核酸提取试剂:组织 DNA提取试剂使用天根公司 TIANamp Genomic DNA kit!’。6.2PCR试剂：dNTP、10XPCR缓冲液~Tuq酶使用-TAKARA~公司产品。6.3引物：上游引物Fop1序列(51-3）：AGGTTCAGCTACAGCATCTATCGC,下游引物 Fop5序列(5′-3):TACCCCTCTGCCATTAGCACC,扩增产物为550 bp。6.4氧化锆颗粒（直径3mm）6.5RPM1640 培养液。７ PCR 检测7.1样本DNA的提取按照附录A进行。7.2反应体系的配制在200μL的PCR反应管中，依次加人下列试剂：灭菌双蒸水14.35μL、10×PCR缓冲液2ul、dNTP(2.5 mmol/L)0.5 μL、10 μmol/L 上游引物 0.5 μL、10 μmol/L 下游引物 0.5 μL、(5 U/μL)Tal0.15μL,模板DNA2μL，总体积为20,uL。设立阴性对照、阳性刘对照和空白对照。将配制完成的反应体系瞬时离心，放人PCR仪。:7.3反应条件PCR反应条件为95℃ 5mn预变性,94℃30s,56°30 s,72:℃ 30 s,35个循环,72℃ 10 min。7.4　结果判定取5μLPCR产物进行2%琼脂糖电